 La fase móvil.

 La fase estacionaria.
 El analito.

 Todas las especies que pueden

disolverse pueden separarse eligiendo la
combinación adecuada de fase móvil y
fase estacionaria
  Elución isocrática

 Elución con gradiente

• Donde se
observa Mejora
de la eficacia de
la separación
mediante la
elución con
gradiente
 Se usan bombas para impulsar a la fase
móvil y deben cumplir los siguientes
requisitos:
• Deben vencer P.
• Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.
• Deben estar libres de pulsaciones y tener volúmenes
muertos pequeños.
• Deben estar construidas de materiales resistentes a la
presión y a las agresiones químicas.
• Fácil manejo y mantenimiento.
 Bomba reciproca
Se utilizan tres tipos de Desventaja:
• Que producen un flujo
bombas : pulsado, que se ha de
amortiguar dado que su
presencia se manifiesta
1. Bombas recíprocas como ruido en la línea
base del
2. Bombas de
cromatograma.
desplazamiento
3. Bombas
neúmaticas
 En cromatografía de líquidos el método
más ampliamente utilizado para la
introducción de la muestra utiliza bucles de
muestra
• Las columnas para cromatografía de
líquidos se construyen de ordinario con
tubo de acero inoxidable de diámetro
interno uniforme, aunque en algunas
ocasiones se encuentran tubos de vidrio de
paredes resistentes. Estas últimas sólo se
utilizan a presiones menores de unos 600
psi.
• La mayoría de las columnas
Recientemente, Se para
cromatografía de líquidos
han empezado a tienen una
longitud entre 10 y 30 cm. Por lo común,
fabricar columnas
las columnas son rectas y se pueden
alargar, si de alta eficacia,
es necesario, acoplando dos
o más columnas.
más rápidas, las
cuales tienen
menores
dimensiones.
 Tipos de rellenos de la columna

 Pelicular : consiste en bolas de silice o

de polímero, no porosas y esféricas con
unos diámetros característicos de 30 a
40 pm.

 Partícula porosa: micropartículas porosas

con diámetros entre 3 y 10 pm y con la
menor dispersión posible con respecto a
un tamaño determinado
Ventajas: Amplio rango de trabajo de pH
Relativa facilidad en su preparación.

Desventajas: Hinchaiento o disminución de las

partículas con el uso de solventes orgánicos
Poca fuerza mecánica.
 Relativamente baja caida de presión
 Alta eficiencia en un amplio rango de
velocidad de flujo
 Fácil de preparar (in situ)
4) Funcionalización
 +

Metacrilato de glicidilo Etilen dimetacrilato

O
O

Funcionalización

O O
 O

O S O
NaO ONa
ONa
O
O
S ONa
O
Cromatografía de intercambio catiónico

CH3
O N CH3 O
CH3 OH
O CH3
+
N CH3
CH3

Cromatografía de intercambio aniónico

• Se divide en C. líquido-líquido y C. de
fase unida químicamente

En fase unida
En líquido-líquido, químicamente, la
la fase estacionaria
fase estacionaria se
líquida
se retiene sobre la une químicamente
superficie del a la superficie
soporte por del soporte
adsorción física.
La cromatografía de reparto se divide en
“fase normal”, y “fase reversa”, cuyas
principales diferencias radican en las
distintas polaridades de sus fases
estacionarias y móviles.

En la cromatografía de fase
reversa su fase estacionaria
es apolar, y la fase móvil
polar.
En la cromatografía normal,
la fase estacionaria es polar y
la móvil apolar
 Una cromatografía exitosa con fases
móviles interactivas, requiere un
equilibrio adecuado entre las fuerzas
intermoleculares existentes entre los tres
participantes activos en el proceso de la
separación

3. fase
1. 2. fase estacionar
Soluto móvil ia
• La cromatografía de adsorción, o
líquido-sólido, es la forma clásica
de cromatografía de líquidos que
introdujo Tswett por vez primera a
principios del siglo XX. Más
recientemente, se ha adaptado
para llegar a convertirse en un
método importante de HPLC
 Fuerza del disolvente: índice es la Fuerza
eluyente

 Elección de los disolventes: se eligen dos

disolventes compatibles
 La cromatografía de adsorción es la más
adecuada para compuestos no polares
probablemente con masas moleculares
inferiores a 5.000
Las modificaciones del disolvente provocan
una gran
 Una de las característica particular de
variación en la resolución y en el tiempo de
esta cromatografía es su capacidad
retención,
y para
sólo diferenciar compuestos
en raras ocasiones no isómeros
se puede
en mezclas
encontrar
la fase móvil adecuada.
Aplicación característica
de la cromatografía de
adsorción: separación de
cis- y trans-pirazolina.

Columna: 100 x 0,3 cm, sílice

pelicular.
Fase móvil: 50 por 100 cloruro de
metilenolisooctano.
Temperatura: ambiente.
Caudal: 0,225 mllmin.
Detector: UV, 254 nm.
 La cromatografía de adsorción es la más
adecuada para compuestos no polares
probablemente con masas moleculares
inferiores a 5.000
Las modificaciones del disolvente provocan
una
 Unagran
de las característica particular de
variación en la resolución
esta cromatografía y capacidad
es su en el tiempo de
retención,
para diferenciar compuestos isómeros
y sólo en raras ocasiones no se puede
en mezclas
encontrar
la fase móvil adecuada.
Aplicación característica
de la cromatografía de
adsorción: separación de
cis- y trans-pirazolina.

Columna: 100 x 0,3 cm, sílice

pelicular.
Fase móvil: 50 por 100 cloruro de
metilenolisooctano.
Temperatura: ambiente.
Caudal: 0,225 mllmin.
Detector: UV, 254 nm.
 Detector de Fluorescencia
Salida flujo

Capilar recubierto de Teflon

TSU 100375

Flujo

Resina epóxica
Fotodetector LED
Ventana PEEK
transparente 1/16 in OD
0.030 in ID
Problema de la elución