Extracción y purificación de

proteínas

Equipo 5
5IM5
Purificación de proteínas

 Consideraciones básicas:
1. Conocer las características propias de la proteína: carga, tamaño, solubilidad,
localización celular y función.
2. La cantidad, es decir la abundancia celular
3. Costos
Purificación de las proteínas

 Consideraciones generales
1. Definir los objetivos de la purificación.
2. Seleccionar el material biológico de inicio.
3. Desarrollar una técnica de análisis.
4. Minimizar la manipulación de la muestra.
5. Remover desde el inicio posibles contaminantes.
6. Reducir el uso de aditivos.
7. Apoyarse en el uso de técnicas diferentes en cada paso.
8. Minimizar el número de pasos.
Protocolo para la purificación de una
proteína

 Ruptura o lisis celular

 Centrifugación diferencial
 Centrifugación en gradientes de densidad
 Precipitación selectiva de proteínas por
adición de sales o solventes
 Separación proteica por carga, tamaño
y afinidad
Criterios para la selección de la fuente
proteica

 Varias pueden ser las fuentes biológicas

 Facilidad para la obtención de la biomasa
 La cantidad de la proteína en el tejido o célula
 Estabilidad
Organelos célula eucariota

Organelos Función

El “cerebro” de una célula; el núcleo de una célula dirige las

Núcleo actividades de las células y contiene material genético llamado
cromosomas, hecho de DNA.

Mitocondria Produce energía de los alimentos

Ribosomas Produce proteínas

Aparato de Golgi Produce, procesa y almacena proteínas

Contiene enzimas digestivas que ayudan a degradar el material

Lisosomas
ingerido

Conocido como la "autopista intracelular", transporta todo tipo de

Retículo endoplasmático (ER)
materiales alrededor de la célula.

De almacenamiento, usualmente las vacuolas contienen agua o

Vacuolas alimento. (¿Tiene sed?. ¡Es posible que sus vacuolas necesiten un
poco de agua!)
Diferencias en la morfología y función de
las células procarióticas y eucarióticas

 La principal diferencia radica en que en los Procariotas el material genético no está

separado del citoplasma y los Eucariotas presentan el material genético está organizado
en cromosomas rodeados por una membrana que los separa del citoplasma.
Lisis celular

 La lisis celular es el proceso de ruptura de la membrana celular de células o bacterias

que produce la salida del material intracelular, provocado por lisinas. Todas las células
tienen una membrana hecha de fosfolípidos que separan el contenido celular del
ambiente extracelular.
Aspectos básicos a considerar durante la
lisis o ruptura celular

 Homogenización: Mecánica, No Mecánica

 Medio homogenización: Ruptura celular

 Medio de resuspensión: Mantenimiento de integridad de organelos

Fraccionamiento subcelular
(Centrifugación diferencial)

 Homogenización (medio isotónico)

 La separación por tamaño
Separación por gradientes de densidad

 Centrifugación isopícnica: Requiere de un gradiente de sacarosa y en la parte superior se

adiciona una mezcla de organelos.
Medios de densidad disponibles para la
separación de los sistemas biológicos

 Alcoholes polihidratados: Son gradientes no iónicos, estables y de bajo costo (sacarosa,

sorbitol, glicerol)
 Polisacáridos: Tienen una fuerza osmótica elevada (ficoll, sacarosa polimerizada con
epiclorohidrina )
 Medios de silica coloidal: No son soluciones, presentan una fuerza osmótica baja y
cambia poco con cambios en la densidad (percoll)
 Gradientes de densidad media que contienen yodo y son no-iónicos: Basados en el
ácido triyodobenzoico
 Sales inorgánicas: Gradientes iónicos de sales de metales pesados usados para
separación de ácidos nucleicos en gradientes isopícnicos
Técnicas para el desalado

Una vez que se ha precipitado la proteína por sales, el siguiente paso consiste en removerla
sal de la muestra.
 Diálisis
 Ultra centrifugación
Principios de precipitación de proteínas
por solventes.

 Las proteínas se mantienen en solución por la interacción de los grupos hidrofílicos de su

superficie con el solvente.
 Si la polaridad del solvente se reduce por la adición de un solvente orgánico menos polar
que el agua, la proteína se vuelve menos soluble.
Precipitación de proteínas por solventes.

 Los dos solventes ampliamente utilizados son el etanol y la acetona. Ambos logran
precipitar adecuadamente a las proteínas, pero la Acetona preserva mejor las
propiedades de las proteínas.
 Los rangos de temperatura usualmente utilizados son: Temperaturas cercanas a 0°C hasta
-20°C.
 Para la recuperación de la proteína se debe centrifugar y puede re suspenderse en un
amortiguador apropiado.
 Desventaja: Bajos rendimientos y puede haber desnaturalización.
Protocolo general para la purificación de
una proteína.

I. Ruptura o lisis celular.

II. Centrifugación diferencial.
III. Centrifugación en gradientes de densidad.
IV. Precipitación selectiva de proteínas por adición de sales o solventes.
V. Separación proteica por carga, tamaño y afinidad.
Separación proteica por carga tamaño y
afinidad.

 Se selecciona el material biológico para obtener el sistema biológico de las células

vegetales con el objetivo de purificar la membrana plasmática de tejidos vegetales
 A partir de un tejido vegetal con disminución en los niveles de esfingolípidos endógenos
se obtiene FM/MP para obtener membranas resistentes al detergente
Caracterización:
 -Ultraestructura por microscopía electrónica de transmisión (MET)
 -Análisis proteómico
 -Cuantificación e identificación de ceramida y de esfingolípidos
 -Cuantificación de ácidos grasos de cadena larga
 -Cuantificación e identificación de esteroles
Separación proteica por carga tamaño y
afinidad.

 Esquema general para la purificación de las VMP:

 Se secan las semillas de maíz, después se diseccionan los embriones para congelarlos en
N2 líquido, pasan a la molienda, desgarrando el tejido en el buffer, filtrando con una
centrifuga a 1500 g x 10 min. Quedando flotante y una parte de fracción nuclear en
donde a cada flotante se le vuelve a filtrar cada vez de acorde a su cantidad (8000 g
x10 min, obteniendo la fracción mitocondrial, 100000 g x 30 min para fracción
microsomal) o se puede ajustar después del primer filtrado a un peso final de 0.9 gramos y
agregar 27 gramos de mezcla de fases para centrifugar 1000g x 5 min, donde la fase
superior se agrega a la fase menor y volver a centrifugar con 1000g x 5 min para después
diluir con sacarosa volviendo a centrifugar 100 000 g x 4 hr obteniendo membranas de
plasma.
Criterios para la selección de los
amortiguadores de homogenización y
suspensión
 Purificación del PM
 Aproximadamente 14,500 embriones de maíz bebido (790 gramos en peso seco) fueron
congelados en nitrógeno líquido y homogeneizado en una licuadora (dos veces por 7
segundos) en una disolución de 1:2 buffer conteniendo 250mM D-Sorbitol, 50mM
Hepes/BTP pH de 7.8, 5mM (DTT), 1mM (EDTA), 1mM KCl, y 1.6 μg/ml de cocktail inhibidor
de proteasa.
 Un total de 250 plantas de frijoles de 8 semanas y plantas de tabaco de 10 a 16 semanas
de edad nacieron, 720 y 737 gramos de peso fresco en hojas fueron cosechadas
respectivamente. Los lotes fueron homogeneizados en una licuadora (2 veces por 7
segundos) en una disolución 1:3 de buffer conteniendo 620mM D-sorbitol, 50mM
Hepes/BTP pH de 7.8, 15mM β-mercaptoetanol, 5mM de ácido ascórbico, 3mM (EDTA),
1mM DTT, 1mM KCl, 0.6% polivinilpirrolidona- 40 y 1.6 μg/ml de cocktail inhibidor de
proteasa
Referencia

 Salazar L, (S.F). Bioquímica y Biología Molecular para la Industria Farmacéutica y Biotecnológica, Facultad
de Química.