UNIDAD 2: MÉTODOS Y TÉCNICAS DE CULTIVO MICROBIANO

MEDIOS DE CULTIVOS
 Un medio de cultivo es cualquier material que presente
un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que crean las condiciones
necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
 Es decir, es cualquier “medio” que proporcione
sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y
reproducción de microorganismos.

 No existiendo un medio de cultivo universal adecuado

para todos ellos.

 Para construir un medio de cultivo para un organismo o

grupo de organismos deben conocerse las necesidades
de los mismos.
CONDICIONES QUE DEBE REUNIR UN MEDIO DE
CULTIVO

Para que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo

artificial debe reunir una serie de condiciones ambientales adecuadas:

pH

Temperatura

Oxígeno y CO2

Presión

Luz

Grado correcto de acidez y alcalinidad

 En los Laboratorios de Microbiología se utiliza una gran
variedad de medios de cultivos para mantener las
cepas, aislar o identificar microorganismos con varia
finalidades: determinar la existencia de contaminación
de alimentos, medicamentos o cosméticos; diagnosticar
alguna enfermedad, elaboración de vacunas
bacterianas, etc.

 Las células microbianas pueden tener entre un 80 a

90% de agua. Su composición elemental, en base seca,
está constituida por un 50% de C, mientras que el otro
50% se distribuye en elementos tales como O, N, H, P,
S, K, Ca, Mg, Fe.
 Carbono (C): Este elemento aporta a los microorganismos esqueletos
carbonados para su crecimiento y multiplicación., de su catabolismo
obtienen energía.

 Ésta energía puede ser suministrado a través de diferentes fuentes, las

orgánicas como los hidratos de carbono (lactosa, sacarosa, maltosa,
dextrosa, xilosa, manita, almidón, etc.), aminoácidos (aa), ácidos
orgánicos, etc. Las fuentes inorgánicas son el amonio, nitritos, azufre y la
luz.

 Nitrógeno (N): Puede encontrarse en la naturaleza tanto en forma

orgánica como inorgánica.

 En el primer caso los microorganismos lo obtienen de la descomposición y

mineralización de aa y bases nitrogenadas y en el segundo caso se
pueden suministrar como sales inorgánicas: KNO3, (NH4)2SO4. El
nitrógeno gaseoso (N2) sólo sirve como fuente para las bacterias fijadoras
de este elemento: Bradyrhizobium, Azotobacter, Anabaena, etc.

 Muchos medios de cultivo presentan en un solo compuesto las fuentes de

nitrógeno y carbono; como aquellos que contienen peptonas,
aminoácidos, o algunas proteínas como la caseína, etc.
 Sales minerales: Son fuente de cationes y de aniones. Todas las
bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos que
se pueden clasificar según las cantidades en los que son
requeridos en macroelementos (K, Na, S, P, Ca, Fe) y
microelementos (Mn, Zn, Co, Cu, Ni).

 Factores de crecimiento: Son aquellos elementos esenciales para

el desarrollo de los microorganismos, y que estos no los pueden
sintetizar a partir de compuestos más simples. Ej.: vitaminas
(biotina, tiamina, niacina), coenzimas, aminoácidos (arginina,
asparagina, cisteína).

 Indicadores de pH: Cumplen la función de visualizar fácilmente si

en un medio hay o no crecimiento, o si acidifica o basifica el medio.
Ej: azul de bromotimol, rojo neutro, rojo de fenol, púrpura de
bromocresol, etc.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Según su estado físico
Líquidos o caldos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes
disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado
número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.

Sólidos
Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes
solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y
mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio.
El agar es un polisacárido complejo, funde aproximadamente a 100ºC y permanece en
estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC. Además, una
vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe.
Los medios con agar se envasan en tubo o en placa de Petri.
Ej. Agar nutritivo.
Según la naturaleza de sus constituyentes
(composición)
 Medios naturales, (Indefinidos) o complejos
 Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal
y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras
sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo,
ni las cantidades exactas en que están presentes.
 Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras, agua, suero, papa, huevos,
leche, sangre, tierra, etc.

 Medios sintéticos (químicamente definidos)

 Están compuestos de substancias que son manipuladas por el hombre
en el laboratorio.

 Un medio del cual se conoce exactamente su composición química se

denomina sintético o químicamente definido; puede ser una simple
solución de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos
compuestos orgánicos.
 CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS ARTIFICIALES COMPLEJOS
SEGÚN SU PROPÓSITO DE USO (UTILIZACIÓN)

El medio de cultivo que se utiliza depende del microorganismo que se está cultivando y el
porqué de dicho cultivo. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos
nutricionales de un organismo y un medio rico

I. Medios comunes: o generales Permiten el desarrollo de una gran variedad de

microorganismos, como el PDA (Agar papa dextrosa) Y AN (agar nutritivo),
caldo nutritivo

II. Medios artificiales complejos:

II.A MEDIOS ENRIQUECIDOS

 Potencian el crecimiento de un determinado

tipo de microorganismo, dejando crecer el
resto en menor proporción. Son medios
destinados al cultivo de microorganismos muy
exigentes.
Ejemplo: el "Agar Sangre" se utiliza para el
cultivo de algunos estreptococos muy
exigentes.
II b. Medios selectivo
 Estos medios han sido modificados de alguna manera para que, en una flora mixta,
permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo tiempo inhiban la
proliferación de la flora acompañante. Para esto último se busca establecer condiciones
desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el agregado de inhibidores.

 Ejemplo: agar desoxicolato citrato diseñado para el aislamiento de patógenos entéricos

 Ej.: caldo nutritivo con NaCl10%, agar nutritivo tamponado a pH 5.

 El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el

desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayoría de las bacterias.
 Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde
brillante), los antibióticos, telurito de potasio, el alcohol fenil etílico y la azida de sodio.
 Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta
se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo
crecerán los que usen maltosa.
 II.b.1 Medios selectivos inhibidores de Gram +:
 Por ejemplo algunos medios de cultivo contienen sales biliares u
otras sustancias como cristal violeta o verde brillante que inhiben el
crecimiento de las bacterias gram +. Estos medios de cultivo son,
entre otros, "agar MacConkey", "agar Eosina- Azul de Metileno" y
"agar Endo

 II.b.2 Medios selectivos antibióticos:

 Otros medios selectivos lo son porque contienen uno o más
antibióticos que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos.
Por ejemplo el "agar SPS" (agar Sulfito sódico- Polimixina-
Sulfadiacina) se utiliza para el recuento de clostridios sulfito-
reductores en aguas. Contiene dos inhibidores (Polimixina y
Sulfadiacina) que impiden el crecimiento de varios microorganismos
distintos de los clostridos
No existen medios de cultivo que sean totalmente selectivos para
un microorganismo.

Por ejemplo no existen medios de cultivo que sean totalmente

selectivos para el crecimiento de Salmonella ya que en los
medios que se pueda desarrollar este microorganismo
habitualmente lo hacen también otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae a la que pertenece.
II.C Medios diferenciales
 Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades (normalmente
bioquímicas) que un determinado microorganismos posee y de esa forma
se puede distinguir ese microorganismo de otros que también pueden
crecer en ese medio.

 Contienen un factor o factores que permite que las colonias de

una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características
metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para
diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar.

 Un ejemplo de este tipo es el agar con eosina azul de metileno que

diferencia Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sobre la base de
la diferencia de color de sus respectivas colonias. Cuando se cultivan
ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color blanco
grisáceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E.
coli son oscuras y con brillo metálico, en cambio las colonias de E.
aerogenes son rosadas con un centro azul y rara vez presentan brillo.
SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
 En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el
agregado de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-
diferenciales resultan muy útiles para el aislamiento de un microorganismo
separándolo de la flora acompañante. Se ponen en evidencia las colonias
de los microorganismos que se desea aislar y a su vez se diferencian de
aquellas que pudieran haber desarrollado provenientes de la flora
acompañante.

Ej.: Un ejemplo es el agar MacConkey.

Es selectivo porque contienen sales biliares que inhiben el crecimiento de
los Gram positivos
Es diferencial porque contiene Lactosa y Rojo Fenol lo que permite
diferenciar los microorganismos que fermentan las Lactosa (lactosa
positivos) de los que no lo hacen (Lactosa negativos).
 Agente Azúcar Sistema
Medio de cultivo Tipo de medio
bacteriostático fermentable Indicador
ALRF (agar diferencial (no
----- lactosa rojo fenol
lactosa rojo fenol) selectivo)
bromuro de
Agar Cetrimide selectivo cetiltrimetil ------- --------
amonio
selectivo y cristal violeta,
Agar Mac Conkey lactosa rojo neutro
diferencial sales biliares
SS agar
selectivo y verde brillante, rojo neutro,
(Salmonella lactosa
diferencial sales biliares citrato férrico
Shigella)
VRBA (violeta selectivo y cristal violeta,
lactosa rojo neutro
rojo bilis agar) diferencial sales biliares
Manitol Salt Agar selectivo y
cloruro de sodio manitol rojo fenol
(Chapman) diferencial
EMB agar (eosin selectivo y eosina y azul de eosina y azul de
lactosa
methylen blue) diferencial metileno metileno
XLD agar (xilosa rojo fenol, citrato
selectivo y desoxicolato de lactosa, xilosa,
lisina férrico amónico y
diferencial sodio sacarosa
desoxicolato) tiosulfato de sodio
indicador de
BiS agar (bismuto selectivo y verde brillante,
glucosa sulfito de Bi y
sulfito) diferencial sulfito de bismuto
sulfato ferroso
selectivo y Cloruro de litio y yema de huevo,
Baird Parker agar ------
diferencial telurito de potasio telurito de potasio
enriquecimiento
TSB + 10% NaCl cloruro de sodio ------ -------
selectivo
Caldo enriquecimiento Tetrationato, sales
------ ------
Tetrationato selectivo biliares
CLBVB (caldo
enriquecimiento verde brillante,
lactosa bilis verde lactosa producción de gas
selectivo sales biliares
brillante)
FACTORES AMBIENTALES
 Además de los nutrientes apropiados es indispensable que los factores
ambientales se ajusten apropiadamente a cada organismo cultivado.
 El establecimiento de un pH óptimo y su mantenimiento durante el
crecimiento es de gran importancia, sobre todo para aquellos
microorganismos que a pesar de producir ácidos no los
 toleran.
 De acuerdo a su pH óptimo los microorganismos se clasifican en:
 Acidófilos: Dentro del pH 3.5 a 5.5 se encuentra la gran mayoría de los
microorganismos. Ej.:hongos y levaduras, bacterias lácticas y acéticas.
 Neutrófilos: Desarrollan dentro del rango de pH 6.5 a 7.5. Ej.: Bacillus,
Azotobacter.
 Basófilos: El pH óptimo de crecimiento y desarrollo es mayor a 7.5. Ej.:
nitritadores, Micrococcus ureae, Bacillus pasteurii, Sarcina urea.
TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN
 En general los microorganismos patógenos de plantas
crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 ºC.

 En ocasiones incubamos a temperaturas

diferentes:
 A 37 ºC cuando queremos descartar el crecimiento
de agentes de control biológico a la temperatura de cuerpo
humano.
 A 5ºC o menos cuando buscamos microorganismos
adaptados a crecer en la cámara frigorífica. Venturia
inaequalis debe incubarse a temperaturas bajas. de entre
16 y 20 ºC
CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD

 Un nivel mínimo de humedad, tanto en el

medio como en la atmósfera, es imprescindible
para un buen desarrollo de las células
vegetativas de los cultivos microbianos.

 En las estufas de cultivo se debe proporcionar

una fuente adecuada de humedad para evitar
así que se deseque el medio
PRESENCIA DE OXÍGENO

 Los microorganismos aerobios necesitan que el

oxígeno llegue en forma adecuada al medio.
 En los medios líquidos se recurre a la agitación,
de lo contrario solamente habrá crecimiento en
la parte superior.
PRESENCIA DE OXÍGENO

 Los anaerobios por el contrario crecen en

ausencia de oxígeno. Ej. Erwinia,
saccharomyces cerevisiae
EL AISLAMIENTO
 Los microorganismos en la naturaleza generalmente se
encuentran como poblaciones mixtas. Para poder
caracterizarlos de manera individual éstos deben
separarse (aislarse), obteniendo un cultivo puro o
axénico. Un cultivo puro está formado por un solo tipo
de microorganismo y es indispensable para conocer sus
características morfológicas y estructurales, actividad
bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos
para su identificación.
 El aislamiento de microorganismos puede realizarse por
métodos de dilución y siembra en medios sólidos o
líquidos, considerando que cada célula bacteriana que
se separa da origen a una colonia visible a simple vista.
MÉTODOS DE SIEMBRA
Según los objetivos que se persigan, es posible diferenciar dos
tipos de siembras:
_ Métodos de siembra destinados al recuento de
microorganismos cuando es necesario conocer la carga
microbiana de un medio (leche, suspensión de suelo, cultivo
líquido de microorganismos)
_ Método de siembra destinado a aislamiento cuando es
necesario separar un microorganismo a partir de una
población que puede contener varios tipos.
Importancia del cultivo de microorganismos:
•Obtención de cultivos puros.
•Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras
características.
•Conteo de colonias (UFC)
• Métodos especiales de cultivo
 Siembra por estría en placa
 Siembra en profundidad (vertido en placa)
 Transferencia aséptica

Consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la

manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles.
Es uno de los primeros métodos que tiene que dominar un microbiólogo.

a.Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar

b. El tubo se destapa
c. Se pasa el extremo del tubo por la llama
d. Se extrae la muestra con el asa esterilizada
e. Se vuelve a flamear la boca del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril
f. Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa de nuevo al final
 Método de siembra destinado a aislamiento

 Para el aislamiento de microorganismos se

1. Siembra por estrías en placa puede aplicar la técnica de aislamiento por
estría o por extensión en superficie (se trasfiere
de 0.1 a 0.5 ml.)
Se esteriliza el asa y
luego se toma una Crecimiento de colonias confluentes
muestra del tubo al comienzo de la siembra por estría

Colonias aisladas al
final
de la siembra por
estría

Se realiza una siembra

por estría en una placa de
agar con medio estéril.
Después de una estría inicial
Se hacen estrías en ángulo
Método de siembra destinado al recuento de
microorganismos

2. Dilución y siembra por

extensión en superficie

Método de vertido
en placa
MORFOLOGÍA COLONIAL
SIEMBRA MASIVA O EXTENSIÓN
 Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar
la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra
liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del
medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento en espiral.
La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo
grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su
deslizamiento sobre toda la superficie de una placa de agar.
TÉCNICA DE LAS DILUCIONES EN SERIE

Dilución Tipo de microorganismo

10-1 a 10-3 Hongos

10-4 a 10-6 Levaduras

10-7 a 10-10 Bacterias

SIEMBRA POR PUNCIÓN
 El instrumento de siembra a emplear será la aguja de
platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en
tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia
de las precauciones de asepsia, son similares que
cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene
este método, es que la aguja (con el inoculo) debe
atravesar perpendicularmente el medio de cultivo.
SIEMBRA MICROBIOLÓGICA EN MEDIOS DE
CULTIVOS DISTRIBUIDOS EN TUBOS DE ENSAYO
 Mantenimiento y preservación de cultivos puros.

- Resiembra periódica en medios frescos.

 Depende de el medio de cultivo

 Temperatura propia para mantener los cultivos

 El tiempo de resiembra.

- Preservación de cultivos con una capa de aceite

mineral.
 Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá
cubrir mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del
agar inclinado.
MANTENIMIENTO Y PRESERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS.

- Liofilización. Proceso utilizado para la

eliminación de agua, mediante desecación al
vacío y a muy bajas temperaturas.

- Almacenamiento a temperaturas muy bajas en

presencia de agentes estabilizantes como
glicerol, dimetilsulfóxido, nitrógeno líquido
(-196ºC)
 La esterilización. es la eliminación o muerte de todos
los organismos vivos de un material. incluyendo
endosporas (enlace) bacterianas. No hay grados de
esterilización; un material está estéril o no lo está.
Para trabajar en el laboratorio de Microbiología es
necesario que todo el material esté estéril y no vuelva
a contaminarse. Solo es posible manejando los
microorganismos con técnicas asépticas
ESTERILIZACIÓN MEDIANTE PRINCIPIOS FÍSICOS

 TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo celular, las

proteínas se desnaturalizan al romperse los enlaces de H y S en sus
estructuras secundarias y terciarias, bajo estas circunstancias se
pierden las actividades funcionales de dichas proteínas como la
funcionalidad enzimática .

Mesofílicas: 25ºC – 37ºC

Psicrofílicas: 4ºC – 10ºC
Termofílicas: 80ºC

Clostridium botulinum

endosporas
Clostridium tetani
 LA UTILIZACIÓN DEL CALOR Y SU EFICACIA DEPENDE DE DOS FACTORES:
EL TIEMPO DE EXPOSICIÓN Y LA TEMPERATURA

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos

efectos se deben principalmente a dos razones:

•El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas
son producidas por reacciones que eliminan agua
•El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más
elevado que el aire.
 Ventajas del calor húmedo:
 Rápido calentamiento y penetración.
 Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo.
 No deja residuos tóxicos.
 Hay un bajo deterioro del material expuesto.
 Económico.
Desventajas:
•No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.
•Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.
CALOR HÚMEDO
 Autoclave: El vapor bajo presión es el agente de
esterilización más eficiente confinamiento de vapor
en un recipiente cerrado, la presión se eleva y la
temperatura aumenta en forma correspondiente.
Con una presión de 1.05 Kg/cm3 o 15lb, la
tempartura del vapor alcanza 121ºC, con una
atmósfera libre de aire durante 15 min

 Elementos del autoclave:

• Sistemas control de presión y válvulas
seguridad
• Llave de purga para eliminar el aire
Indicador Biológico:
Bacillus sterothermophillus
 CALOR SECO
 El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico
por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas.
 Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los
materiales a los microorganismos que están en contacto con
éstos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y
lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está
seco o la actividad de agua del medio es baja.
Ventajas del calor seco:
•No es corrosivo para metales e instrumentos.
•Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no volátiles.
Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja
penetración del calor.
MÉTODOS POR CALOR SECO:
 Estufas de aire caliente. Estas constan de una
doble cámara, el aire caliente generado por una
resistencia eléctrica circula por la cavidad principal
y por el espacio entre ambas cámaras, a
temperaturas variables, entre 180ºC – 250ºC,
ciclos de 1-2 h.
 Indicador Biológico: B. Subtilis var. Niger

 Tipo de material:
• Instrumental quirúrgico (metálico)
• Material de vidrio, porcelana y metal
• Polvos termoestables
• Grasas, aceites, parafinas, ceras....
 Llama directa
 Consiste en colocar el material directamente
al fuego hasta que éste se ponga al rojo
vivo. De esta forma se queman los
contaminantes hasta reducirlos a cenizas.
 En microbiología para esterilizar el asa con
la llama del mechero.
.
AGENTES QUÍMICOS

 Algunas sustancias químicas pueden ser usadas

como agentes esterilizantes porque tienen la
capacidad de promover una o más reacciones
químicas capaces de dañar los componentes
celulares de los microorganismos (proteínas,
membranas, etc.)Estos métodos provocan la
perdida de viabilidad de los microorganismos.

 Antiséptico
 Desinfectante
 Conservadores
ANTISÉPTICO

 Agentes microbicidas que pueden aplicarse

sobre la piel y mucosas, pero no pueden
usarse internamente.
DESINFECTANTES
 Agentes que matan microorganismos pero no
necesariamente sus esporas y no deben aplicarse
sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como
mesas, pisos, utensilios, etc.
Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados,
soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio
cuaternario, cloruro de benzalconio, etc.