Modele fenotipice

de microarray la
studiul
procariotelor

Butură Mihail
BMC, Gr. A
 Introducere
• Progresele remarcabile ale tehnologiei de secvenţiere au
făcut posibilă obţinerea informaţiilor complete despre
genomul unei procariote într-o fracţiune a timpului şi a
costului, comparativ cu un deceniu în urmă.
Complementară tehnologiei de secvenţiere a genomului cu
o viteză mare de tranziţie a fost dezvoltarea bioinformaticii
şi a avansatei tehnologii ADN microarray, tehnologii care
au împreună analize avansate ale genomului. În contrast,
abordările de mare viteză pentru analizele fenotipice ale
celulelor integrale au fost unul dintre etapele limitative
pentru progresul în profilaxia metabolică și identificarea
funcțiilor genelor necunoscute. Un caz în acest sens este
Escherichia coli K-12, unul dintre cele mai studiate
microorganisme.
 Studii microarray fenotipice cu mutaţii e.coli K-12
pentru toate sistemele de componente
• Un sistem de transducție a semnalelor studiat pe scară largă în bacterii este
sistemul de transducție semnal cu două componente, care constă dintr-un
senzor de histidin-kinază (HK) și o proteină de reglare a răspunsului (RR).
Ca răspuns la stimulii de mediu, cum ar fi schimbările în nivelurile de
fosfat sau azot sau osmolaritatea, senzorul monomer HK dimerizează și
autofosforilează un reziduu conservat de histidină. Porțiunea fosfat este
apoi transferată la un reziduu de aspartat în RR, determinând astfel
activarea sa. RR activat, la rândul său, acționează, în majoritatea cazurilor,
la nivel transcripțional fie ca activator, fie ca un represor, afectând astfel
expresia unui număr de gene. Pe baza dovezilor experimentale și a analizei
secvenței genomice, 37 de sisteme cu două componente au fost identificate
până în prezent în E. coli K-12. Dezvoltarea unei metode rapide de
recombinare genetică pentru a perturba genele în E. coli K-12 a permis lui
Wanner și colegilor săi să construiască deleții în fiecare din cele 37 de
sisteme cu două componente din E. coli K-12.
• Aceste construcții le-au permis să confirme fenotipurile cunoscute
ale unor sisteme bine structurate, cum ar fi NtrB / NtrC și PhoR /
PhoB pentru achiziția de azot și fosfat, și să identifice dacă au
posibile funcții neidentificate până în prezent . În plus, un astfel de
studiu ar putea, de asemenea, să definească funcții pentru sistemele
cu două componente mai puțin studiate, cum ar fi QseC / QseB care
este implicat în detectarea cvorumului și RstB / RstA a cărui funcție
nu este încă cunoscută. Cu mutații de ștergere ale sistemelor cu două
componente în mână, Wanner și colegii au efectuat o investigație
sistematică asupra proprietăților lor fenotipice prin microarray
fenotipic. Rezultatul acestor experimente a arătat că 22 din cele 37
de mutante au prezentat fenotipuri modificate în comparație cu
tulpina izogenică parentală, iar 15 mutanți nu au prezentat nici un
fenotip modificat. Cea mai mare parte a fenotipurilor cunoscute din
fișierele sistemelor cu două componente bine studiate au fost
detectate; noi fenotipuri au fost detectate în 14 sisteme cu două
componente și unele dintre ele au fost foarte pleiotropice.
 Descifrarea funcţiei operonului b1012
în e.coli K-12
• Sistemul bicomponent NtrB / NtrC este reglementatorul global
pentru utilizarea azotului în E. coli. În condiții de limitare a azotului,
NtrB fosforilează Ntr C, iar Ntr C fosforilat activează un număr de
gene implicate în absorbția surselor de azot și catabolismul. Într-un
studiu cu microarray genomic pentru investigarea genelor în E. coli
K-12 a căror expresie este controlată de Ntr C, sa constatat că
expresia a 2% din genom era sub controlul Ntr C. Foarte important,
sa observat că operonul b1012, care cuprinde șapte gene cu funcții
neidentificate, a fost foarte exprimat. Pe baza asemănărilor cu
secvențele de proteine, a fost prevăzută ca unul dintre genele
operonului b1012, b1006 să fie un transportor de nucleobază.
Folosind tulpinile de E. coli K-12 care transporta inserții mini-Tn5
în multe dintre genele operonului b1012, Kustu și colegii săi au
efectuat o microarray fenotipică la temperatura camerei numai cu
placa PM3, care conține diferite surse de azot.
• Rezultatele au arătat că tulpinile mamă au utilizat pirimidinele,
uracilul, uridina, timina și timidina, ca surse de azot unice, în timp
ce tulpinile mutante nu au făcut-o. Rezultatele microarray fenotipice
au fost, de asemenea, confruntate cu experimente de creștere.
Rezultatele au fost surprinzătoare din două motive: E-coli K-12 sa
crezut că nu este capabilă să catabolizeze pirimidinele în ciuda unui
raport precoce pe care ar putea-o face; iar utilizarea de pirimidine în
E. coli K-12 ar putea fi detectată numai la temperatura camerei și nu
la 37 ° C. Probabil din ultimul motiv, catabolismul pirimidinei în E.
coli K-12 nu a fost bine stabilit deoarece experimentele au fost
efectuate la 37 ° C și nu la temperatura camerei. Cel mai important,
un fenotip ar putea fi atribuit operonului b1012. Operonul b1012 a
fost denumit Rut pentru utlizarea pirimidinei, iar cele șapte gene au
fost denumite rutA-G, a opta gena, rutR, este represorul operonului.
 Căile catabolice ale pirimidinei. Calea reductivă (partea superioară) este larg
răspândită și se găsește în archaea, bacterii și oameni. Calea oxidativă (partea
de jos) care se găsește în bacterii nu a fost studiată cu multă detaliere. Calea
Rut (mijlocul) este calea nou descoperită în E. coli K-12, discutată în text.
 Investigarea schimbărilor fenotipice la Bacillus Subtilis ce
prezintă mutanţi rpoB rifampicin-rezistenţi

• Un studiu fenotipic cu microarray a fost recent efectuat cu mutanți rpoB rezistenți

la rifampicină din Bacillus subtilis pentru a identifica modificările fenotipice care
sunt cauzate de astfel de mutații. Gena rpoB codifică subunitatea β a ARN
polimerazei, care este ținta antibioticului rifampicină (Rif). Mutațiile din gena rpoB
care modifică reziduurile critice de aminoacizi din subunitatea β și sunt implicate în
legarea rifampicinei conduc la rezistența la rifampicină (Rif r), deoarece antibioticul
nu se mai poate lega la subunitățile β mutante. Mai mult, subunitatea β este
implicată în interacțiunea factorilor de transcripție auxiliari, iar mutațiile care
determină Rif r pot afecta, de asemenea, interacțiunile cu acești factori auxiliari. S-a
raportat că mutantele Rif r ale B. subtilis afectează modificările globale ale
transcripției, provocând astfel un efect pleiotropic asupra fiziologiei sale. În studiul
fenotipic cu microarray, 11 mutanți Rif r de B. subtilis au fost utilizați pentru a
identifica schimbări în activitățile metabolice la acești mutanți. Numai unul dintre
mutanții Rif r ar putea utiliza L-arabinoză sau D-xiloză. Utilizarea salicinei și a D-
trehalozelor, pe de altă parte, a rămas la fel ca tipul sălbatic în majoritatea
mutanților. Deși genele implicate în absorbția și catabolismul lor nu sunt cunoscute,
acestea au fost foarte probabil reglate în susținerea unor mutații Rif r, permițându-le
să utilizeze aceste zaharuri. Identificarea genelor implicate în utilizarea acestor
surse de carbon rămâne o provocare.
 Identificare markerilor fenotipici ce ajută la
identificarea toxiinfecţiilor alimentare interne
• În laborator, tehnica microarray fenotipică a fost utilizată pentru a
identifica și a detecta agenții patogeni enterocolici negativi, cum ar fi
E. coli O157: H7, Salmonella și Shigella, din focarele alimentare.
Semnele fenotipice și genetice sunt utilizate în mod obișnuit pentru
identificarea și caracterizarea microbilor; cu toate acestea, cu un
număr din ce în ce mai mare de secvențe de genom microbiene
disponibile, este de asemenea evident că diversitatea genetică în
rândul tulpinilor strâns legate nu este neobișnuită. A fost efectuată o
microarray fenotipică a izolatelor patogene de E. coli din colecția
noastră de referință care a inclus 120 de izolate de E. coli O157: H7
enterohemoragice E. coli O157: H7 pentru a crea o bază de date
fenotipică, care ar putea fi apoi utilizată pentru a explora amploarea
variației fenotipice între în cadrul unui subspecific bacterian, precum
și pentru a identifica noi fenotipuri care ar putea apărea în izolaturi
din focarele viitoare alimentate. Am validat sistemul prin verificarea
fenotipurilor care disting între tulpinile E. coli O157: H7 și E. coli K-
12.
• Analiza bioinformatică a secvenței genomului K-12 din E. coli a
identificat inițial unele dintre genele de utilizare a Aga. Calea
catabolică completă pentru Aga și Gam a venit din munca făcută cu
E. coli C care, spre deosebire de E. coli K-12, are setul complet de
gene pentru absorbția și utilizarea acestor două amino-zaharuri.
Clusterul de gene aga / gam în E. coli C are lungimea de 11,5 kb și
codifică 13 gene. În E. coli C, Aga și Gam sunt transportați în celulă
de către sistemul fosfeno-piruvat-carbohidrat de fosfotransferază
(PTS), descris inițial în 1964 de către Roseman și colegi, și este un
sistem de transport cu carbohidrați bacterieni foarte răspândit și
foarte bine studiat. Proteinele care alcătuiesc PTS iau parte la
transferul secvențial al fragmentului fosfat din fosfoenolpiruvat la
molecula de carbohidrat, având ca rezultat fosforilarea concomitentă
a carbohidratului și transportul acestuia în celulă. PTS este alcătuit
din proteine ​solubile Enzima I și HPr; acestea participă la
fosforilarea tuturor carbohidraților PTS și a enzimei II (EII), care
sunt specifici pentru un carbohidrat. Proteinele EII sunt compuse din
două sau mai multe proteine, dintre care cel puțin una este o
proteină legată de membrană sau o singură proteină cu trei domenii.
 Harta genetică a grupului aga / gam în E. coli C și E. coli O157: H7. Setul
complet de 13 gene din clusterul aga / gam în E. coli C și direcția de
transcriere a genelor sunt prezentate în harta de sus. Cu excepția agenților a
căror funcție nu este cunoscută, funcțiile proteinelor pe care fiecare cod de
gene sunt indicate deasupra genelor respective. E. coli O157: H7 are o hartă
genetică identică (partea de jos), cu excepția faptului că îi lipsește o IIC Gam
funcțională și o deaminază / izomerază din cauza codonilor de stop prematur în
genele lor respective, așa cum este descris în text.
Calea catabolică a Aga și Gam în E. coli C. Diagrama schematică care prezintă calea catabolică a Aga și
Gam în E. coli C, care este descrisă în text. Genele care codifică enzimele din cale sunt indicate în
paranteze. EII Aga este compusă din proteine IIB Aga (agaV), IIC Aga (agaW), IID Aga (agaE) și IIA
Aga / Gam (agaF); EII Gam este alcătuit din proteine IIB Gam (agaB), Gam IIC (agaC), Gam IID (agaD)
și IIA Aga / Gam (agaF). În ambele complexe EII Aga și EII Gam, IIA și IIB sunt proteine solubile, în
timp ce IIC și IID sunt proteine cu membrană.
 Concluzii
Acestea sunt doar câteva studii recente pentru a ilustra modul în care
sistemul microarray fenotipic poate servi drept o metodă rapidă de
efectuare a studiilor de profilaxie fenotipică și metabolică în bacterii.
Utilitatea sa în identificarea modificărilor fenotipice care apar din mutațiile
genetice este demonstrată. Mai mult, această tehnologie devine mai
importantă acum din perspectiva numărului mare de secvențe genomice
bacteriene disponibile, ceea ce face posibilă identificarea funcțiilor pentru
secvențe ORF necunoscute și identificarea bazei genetice pentru
fenotipurile identificate. Sistemul, totuși, are limitările sale. Se limitează la
detectarea modificărilor metabolice care afectează fenotipurile și
sensibilitatea sau rezistența la antibiotice și substanțe chimice din mediul
bacterian. Astfel, această tehnică nu va fi utilă pentru detectarea multor alte
mutații, cum ar fi mutații în genele de diviziune celulară care au ca rezultat
alungirea celulelor sau mutații în gene de chemotaxie. În ciuda acestor
limitări, avantajele sistemului microarray fenotipic o fac în mod clar o
tehnică inestimabilă de mare performanță în studiul fenotipic al bacteriilor
care pot fi utilizate pentru completarea studiilor privind genomica.