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TM DAVID SIQUEROS

OBJETIVOS

COMPREDER EL PRINCIPIO INMUNOLOGICO DE LA


TECNICA DE INMUNOENSAYOS, SUS APLICACIONES Y
LIMITACIONES EN EL DIAGNOSTICO CLINICO POR EL
LABORATORIO
CONTENIDO

PRINCIPIO DE LAS TECNICAS


CLASIFICACION DE LAS TECNICAS DE INMUNOENSAYOS
PROCEDIEMIENTO
APLICACIONES CLINICAS
INTRODUCCION A LOS INMUNOENSAYOS
 Inmunoensayo es una prueba que usa complejos de
anticuerpo y antígeno como medio para generar un
resultado perceptible. Un complejo
anticuerpo/antígeno también es conocido como
inmuno-complejo.
 “Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que
hace que el cuerpo genere anticuerpos.
 “Ensayo” se refiere a una prueba. Entonces, un
 inmunoensayo es una prueba que utiliza
inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los
antígenos.
INTRODUCCION A LOS INMUNOENSAYOS
 Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de
pruebas de laboratorio, como las pruebas colorimétricas,
ya que usan complejos anticuerpo/antígeno para generar
una señal que pueda medirse. En oposición, la mayoría
de las pruebas de rutina de química clínica utilizan
Reacciones químicas entre el reactivo (solución de
sustancias químicas u otros agentes) y la muestra del
paciente para generar un resultado de la prueba.
INTRODUCCION A LOS INMUNOENSAYOS
 INMUNOENSAYOS: ANTICUERPOS, ANTIGENOS
Y ANALITOS
Anticuerpo es una proteína producida por el cuerpo
en respuesta a una sustancia “invasora” (extraña). Los
anticuerpos se producen como parte de la respuesta
inmunológica del cuerpo para protegerse.

Antígeno es la sustancia que el cuerpo está tratando de


“combatir” (eliminar o reducir) preparando una
respuesta inmunológica. Algunos test de inmunoensayos
determinan la presencia de antígenos directamente, en
vez de buscar anticuerpos.
INTRODUCCION A LOS INMUNOENSAYOS

 Analito es todo lo que se mide en una


prueba de laboratorio.
En el inmunoensayo, el analito puede ser
tanto un anticuerpo como un antígeno.
INMUNOENSAYOS
 Para poder utilizar la reacción Ag- Ac en un
inmunoensayo, siempre debe buscarse una
forma de hacer evidente esa reacción
(revelado).
 Hay diferentes metodologías de detección.
INMUNOENSAYOS
 ENSAYOS MARCADOS
Coloides
metálicos
Complejos de Ru
Látex
Enzimas
Marcado

Fluoróforo Radioisótopos

Hematíes Partículas de
colorante
Según el diseño del ensayo
 CLASIFICACION

De reactivo limitado o competitivos


(inmunoensayos propiamente dichos)

De reactivo en exceso o no
competitivos (ensayos
inmunométricos)
CARACTERISTICAS DE LA INTERACCION
ANTIGENO-ANTICUERPO
Específica
Reversible
 Dependiente de Ph
 Sensible a la Temperatura
 Sensible a la fuerza iónica
Fuerzas implicadas en la
Interación Antígeno - Anticuerpo

 Puentes de hidrógeno
 Fuerzas electrostáticas (enlaces iónicos)
 Fuerzas de van der Waals
 Enlaces hidrófobicos

AFINIDAD Y AVIDEZ
Afinidad y Avidez de un
anticuerpo por un epitopo
Afinidad
Suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas
entre un sitio de unión del anticuerpo (paratopo)
y el correspondiente epitopo.

Avidez
Fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une
a un Antígeno multivalente. Su valor es mucho mayor
que la suma de las afinidades.
Caracteristicas de los Imnunoensayos
Como Tecnicas de Diagnostico
Especificidad
Sensibilidad
Estabilidad
Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, etc.
Tiempo de ejecución razonable: minutos a ~ hrs
Costo conveniente
Infraestructura mínima
EIA
ELISA: ENZYME LINKED INMUNOSORBENT ASSAY

ANALISIS DE INMUNOABSORSION ENZIMATICA

PRINCIPIO: DETECCION CUANTITATIVA O


CUALITATIVA DE UN Ag O Ac POR MEDIO DE
UNA MOLECULA INDICADORA, LA CUAL SE
ENCUENTRA UNIDA COVALENTEMENTE A UNA
ENZIMA.
¿En el laboratorio de inmunología clínica,
qué fluidos biológicos se utilizan?

 Suero
 LCR
 Fluido sinovial
 Saliva
 Fluido pleural, pericárdico, peritoneal, lavado
broncoalveolar
 Orina
 Aspirado de médula ósea – sangre periférica
Ag IgM IgG
Concentración Relativa

Infection

Seroconversion Dias Semanas Meses Años

Respuesta Immunologica
INMUNOENZIMÁTICAS

Revelan la unión Ag – Ac utilizando


anticuerpos conjugados a enzimas
(Peroxidasa, Fosfatasa alcalina) que al
agregarle su sustrato, lo degradan y
provocan una reacción cromogénica.
COMPONENTES : EIA
 FASE SOLIDA

 CONJUGADO

 REVELADOR
METODOS INMUNOLOGICOS USADOS PARA EL
DOSAJE DE SUSTANCIAS BIOLOGICAS
EN UN EIA TIENE QUE HABER 2 TIPO DE
REACCIONES:

REACCION Ag-Ac

REACCION DE AMPLIFICACION DE LA Rx Ag-Ac.


PRINCIPIO DE EIA
 LAS REACCIONES OCURREN EN DOS ETAPAS:
I.-ETAPA: REACCION Ag-Ac.

+
Acs Antigenos Rx Ag-Ac
 II ETAPA: EFECTO AMPLIFICADOR DADO POR LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA

E E
+ E E +
E E

Rx Ag-Ac 2do. Ac. Unido a la Enzima Reaccion con el sustrato COLOR


AMPLIFICACION
Elisa: Reacción Antígeno-Anticuerpo

Antígeno Anticuerpo
Elisa: Reacción Muestra-Conjugado
Elisa: Reacción del Sustrato Cromogeno TMB
OP
D
O2

H2 O2

H 2O
Buffer Sustrato
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IgG detection
TMB

Fase
Solida Muestra Conjugado
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Detección de Antígeno

TMB

Fase
Muestra Conjugado
Solida
1.- Dispensando la muestra

Dispensando muestra Lavado


e incubando

37°C
2.- Dispensando el conjugado
Dispensando el Conjugate Lavando
e incubando

37°C
3.- Dispensando el sustrato
Dispensando Sustrato
e incubando

TMB
H 2O2
H2O2 TMB TMB
Temp. Amb.
TMB H 2 O2
H2O2 TMB
4.- Reacción de Parada

H2SO4
5.- Lectura de Absorbancia
Fotocelda

LECTURA DE
DENSIDADES OPTICAS

Filtro 450 nm

Procesamiento
De Datos
Fuente de Luz
Controles y Muestras
 Control Negativo asegura que la
placa no reaccione
inespecificamente. P P P N N B

 Control Positive asegura que la


placa reaccione
correctamentefrente a una
muestra positiva.
 Control Negativo y Control
Positivo: Calculo del Cut-Off
 Pozo Blanco asegura que el
sustrato adicionado no adicione un
background (color de fondo) en la
placa.
Dispensado de muestras y controles

Incubación

Lavado

Dispensado de Conjugados

Incubación

Lavado

Dispensado de Sustrato

Incubación

Dispensado de Parada

Lectura a 450 nm
Ensayo Cualitativo
Densidad Optica

2000
1800
1600
1400
1200
1000
800 Positivo
Zona Gris
600
400
200
0
Negativo
Ensayo Cuantitativo:
Curva de Calibración
Optical density

2000 Calibrador 2
1800
1600
1400
1200
1000
800
600 Sample
400
200
0 Calibradtor 1

10 IU 35 IU 200 IU
Concentración
Posesionamiento del
Valor de corte Cut-off (COV)
Numero de casos

Población Positiva

Negativos COV

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Densidad Optica
TIPOS DE EIA
I.- EIA HOMOGENEO (EMIT)

II.- EIA HETEROGENEO (ELISAS)

A) ELISA COMPETITIVO
-Ag INMOVILIZADO
- Ac INMOVILIZADO

B) ELISA TIPO SANDWICH


- DOBLE Ac MARCADO
- TRIPLE Ac MARCADO

C) ELISA INMUNOENZIMETRICO
Técnicas de Inmunoensayo
Homogéneas y Heterogéneas
 A las técnicas de inmunoensayo que
requieren la separación del complejo
unido Ab-Ag* se las conoce como
inmunoensayos heterogéneos.
Aquellas que no requieren separación
se denominan inmunoensayos
homogéneos.
EIA HOMOGENEO
ES UN EIA POR INHIBICION COMPETITIVA DEL
SITIO DE UNION DE LA ENZIMA POR EL
SUSTRATO.
La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los EIA
homogéneos se realiza por cambios(modulación) en la
señal proveniente de la UNION sin hacer separación
física de las formas libre y unida.
El cambio de señal depende de la inhibición ,
activación o cambios conformacionales en la
enzima.
EIA HOMOGENEO
 Las técnicas homogéneas generalmente se
han aplicado a la medición de pequeños
analitos como por ejemplo las drogas de
abuso y terapéuticas. Debido a que las
técnicas homogéneas no requieren la
separación de la unión Ab-Ag* del Ag* libre,
generalmente son más fáciles y más rápidas
de realizar.
EIA HOMOGENEO
I) ETAPA

C
C + +
C
C
Anticuerpo Antigeno Conjugado Ag-Enzima

Toda esta etapa se hace en una sola fase, no hay pasos intermedios de lavados
O sustancias intermediarias que interfieran en la reaccion.
II) ETAPA

C
C
C +
C
C
C

Aqui se va a producir una una inhibicion competitiva de la enzima


por el sustrato.
EIA Homogéneos

Ag
Ag
Enzima

Sustrato
Ag
EIA HOMOGENEO

Enzima activa Enzima inactiva

S
E
Ag

Detección y cuantificación:
Las medidas se pueden hacer con un simple
espectrofotómetro o con un analizador
automático de química clínica.
III.- ETAPA.- MEDICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
FOTOMETRICAMENTE

EL SUSTRATO SE UNE AL CONJUGADO LIBRE,


PORQUE LA ENZIMA CONJUGADA UNIDA AL
ANTIGENO YA QUEDA INHIBIDO.
EL COLOR ES DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A
LA CONCENTRCION DEL ANTIGENO O DE LA
MUESTRA ESTUDIADA.

ESTE METODO SE UTILIZA SOLO PARA MEDIR


MOLECULAS PROTEICAS DE BAJO PESO
MOLECULAR Y EN MONIOTREO DE DROGAS
TERAPEUTICAS O DE ABUSO
EIA Homogéneos:
 Ventajas Más precisos
 En general automatizados, se llevan a cabo sin
entrenamiento especial
 Desventajas:
 Son más costosos en reactivos
 En general sólo sirven para fármacos
EIA HETEROGENEO (ELISA)
 Los ELISA es una técnica analítica basadas en
interacciones específicas de anticuerpo-antígeno que
producen una señal mensurable que puede
relacionarse con la concentración de un compuesto en
solución, aquí hay procesos de separacion de la
fraccion unida y libre.
 El color de mide fotometricamente, es una tecnica mas
sensible que el EMIT.
 Este tipo de tecnica nos va permitir medir proteinas de
alto peso molecular.
Heterogéneos

 Ventajas :
 Menos interferencias, más específicos y sensibles
 Instrumentación menos costosa
 Admiten mayor tamaño de muestra, así
disminuye el límite de detección.
 Más versátiles en cuanto a tipo de analito
 Desventajas :
 Más difíciles de automatizar
 Mayor tiempo de análisis
1.- REACCION Ag-Ac

+
Acs Antigenos Rx Ag-Ac
2.- REACCION INDICADORA
UNION DEL CONJUGADO EN EL COMPLEJO Ag-Ac

E E E
+ E E E
E E

EN ESTA ETAPA SE REMUEVE MEDIANTE LAVADOS SUSTANCIAS QUE


PODRIAN INTERFERIR EN LA REACCION
3.- REACCION ENZIMATICA Y
MEDICION FOTOMETRICA

E
E + COLOR
E

Rx Ag-Ac Sustrato Medicion Fotometrica


ELISA COMPETITIVOS
 Competitivos:
 Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de
antígeno o anticuerpo.
 Una cantidad limitada de anticuerpos que es
insuficiente para unir todo el antígeno.
 El antígeno marcado compite con el antígeno sin
marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito
se determina a partir de la regresión
correspondiente.
ELISA COMPETITIVO
 En los formatos competitivos, el analito sin marcar
(generalmente antígeno) en la muestra se mide por
su capacidad para competir con un antígeno
marcado en el inmunoensayo. El antígeno sin
marcar bloquea la capacidad del antígeno marcado
de unirse puesto que ese punto de unión en el
anticuerpo ya se encuentra ocupado
ELISA COMPETITIVO
 Así, en un inmunoensayo competitivo La
concentración de antígeno en la muestra está
inversamente relacionada a la concentración del
analito .
Relacion Indirecta

Señal

Concentracion
ELISA COMPETITIVO
Legenda

Y
E Conjugados
Antígeno Livre
Enzima
YYY

E
Anticorpo Ligado

YY
Anticorpo I gG
Substrato
Livre

Antígeno Ligado
Y
Y
Y

YY
Anticorpo I gM Produto Final
Y Livre Colorido
Y
Y

YY

Trei nament o IDD 3


Dade Behring M ai o 2001
COMPETITIVO- CAPTURA DE ANTICUERPOS

E
Ac marcado
E

+
E
Ag muestra Sustrato
Señal

Ag muestra
+
Ac marcado
Señal

[Ag]
COMPETITIVO- CAPTURA DE ANTÍGENO

Señal

Antígeno marcado

[Ag]
Muestra
Señal

Lavado
ELISA NO COMPETITIVO
 Los formatos de ensayo no competitivos generalmente
proporcionan el nivel más alto de sensibilidad y
especificidad del ensayo y se aplican a la medición de
analitos críticos como pueden ser los marcadores
cardíacos y de hepatitis. A este formato se lo conoce
como ensayo “sandwich” ya que el analito está unido
(como un sandwich) entre dos reactivos de anticuerpo
muy específicos
ELISA no competitivos
 El antígeno a cuantificar se une a un exceso de
anticuerpos.
 Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase
sólida, revelando con anticuerpo marcado.
 La concentración de antígeno se determina a partir
de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.
ELISA NO COMPETITIVO
 En los ensayos no competitivos, la medición del analito
marcado, generalmente un anticuerpo, es directamente
proporcional a la concentración de antígeno
presente en la muestra. Esto puede representarse
por medio de una curva de respuesta a la concentración.

Relacion Directa

Señal

Concentracion
ELISA TIPO SANDWICH
Técnica Sanduíche A ntígeno

Y Y Y + E Y E
+
Y Y E

Y E +
Y E DO aumenta com
aumento

Y E
atividade anticorpo
Y E

Trei nament o IDD 4


Dade Behring M ai o 2001
Técnica Sanduíche Anti corpo

Y
E
Y YY

Y YY

Y YY
Y
+ E
+

Y
E
Y

E Y
E
YY Y

YY Y

DO aumenta com
+ aumento
concentr ação antígeno
Y

E E

Trei nament o IDD 5


Dade Behring M ai o 2001
EIA Sanduíche I ndireto

Y Y
Y Y

Y Y
E

Y
+ Y Y + E
E
Y Y

Y Y
Y Y

Y Y
E + E DO aumento com
aumento
E E atividade anticorpo

Trei nament o ID D 7
D ade Behring M ai o 2001
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
IgM detección: Immunocaptura

TMB

Fase Muestra Conjugado


Sólida
EIA Captura Anti-µ
+ E
+ Y

+ DO aumenta com
aumento
atividade anticorpo
Técnica de Amplificação Biotina-
Estreptavidina
Y Y Y

Y Y Y

Y Y Y
+ + +

Y Y Y
Y Y Y

+
Tecnologías de Detección del
Inmunoensayo
INMUNOENSAYO POR
POLARIZACIÓN DE
FLUORESCENCIA – FPIA
Inmunoensayo por Polarización de Fluorescencia (FPIA) es un
tipo de inmunoensayo homogéneo competitivo por
fluorescencia. Con la unión competitiva, el antígeno de una
muestra y el reactivo marcado antígeno-fluoresceína (AgF)
compiten por los puntos de unión en el anticuerpo. Como
inmunoensayo homogéneo, la reacción se lleva a cabo en una
solución de reacción simple, y el complejo Ab-AgF no requiere
un paso de lavado para separarlo de
la marca AgF “libre”.
INMUNOENSAYO POR POLARIZACION DE
FLUORESCENCIA (FPIA)

Analito (Muestra) Ag
F Ab/Ag
+ +
F
Anticuerpo Ab Antigeno Marcado Ag*F
Reactivo

Ab/Ag*F
Inmunoensayo por Polarización de
Fluorescencia – FPIA
FPIA utiliza tres conceptos claves para medir
analitos específicos en un formato homogéneo:
fluorescencia, rotación de moléculas en
la solución y luz polarizada.
Fluorescencia: La fluoresceína es una marca
fluorescente. Absorbe la energía de la luz a 490nm y
libera esta energía a una longitud de onda superior
(520nm) como luz fluorescente
Inmunoensayo por Polarización de
Fluorescencia – FPIA
Inmunoensayo por Polarización de
Fluorescencia – FPIA
Luz Polarizada: La tecnología de polarización por
fluorescencia distingue la marca antígeno-
fluoresceína (AgF) del antígeno-fluoresceína
(Ab-AgF) unido al anticuerpo por sus diferentes
propiedades de polarización por fluorescencia
cuando son expuestos a la luz polarizada
Inmunoensayo por Polarización de
Fluorescencia – FPIA
Los resultados de FPIA se muestran como una curva
inversa por cuanto a valores bajos de analito del paciente
producen una señal más alta (en este caso, la señal es luz
polarizada). Una señal alta a niveles bajos de analitos del
paciente dan como resultado un ensayo muy sensible
Relacion Indirecta

Señal

Concentracion
Inmunoensayo por
Micropartícula – MEIA
El Inmunoensayo por micropartícula (MEIA) es una
técnica de inmunoensayo que utiliza el aislamiento de
complejos anticuerpo/antígeno en una superficie de fase
sólida de pequeñas esferas denominadas micropartículas.
MEIA se ha adaptado ampliamente para automatizar la
medición de moléculas grandes como por ejemplo
marcadores asociados al análisis cardíaco, de fertilidad, de
cáncer, metabólico, de hepatitis, y de tiroides.
Inmunoensayo por Micropartícula – MEIA
Los componentes de MEIA incluyen , para el ensayo, lo siguiente:
– Fase Sólida Micropartícula-Anticuerpo : Micropartículas de látex
que están recubiertas con un anticuerpo para unirse al analito específico
que está siendo medido.
– Conjugado Anticuerpo-Enzima: Enzima Fosfatasa Alcalina unida al
Anticuerpo.
– Sustrato de Enzima: Fosfatasa 4-Metil Umbelliferona Fluorescente
(MUP) en solución, la que está disponible para una reacción con la enzima
en el anticuerpo.

F
MUP
F
F
Microparticulas/Anticuerpos Anticuerpo conjugado Sustrato
Fosfatasa Alcalina
Las micropartículas
recubiertas con anticuerpos
antianalito y muestra se
incuban juntas para formar
unamezcla de reacción.

Se transfiere una alícuota de la


mezcla de reacción a la matriz de
figra de vidrio.

Se deja que los anticuerpos


antianalito marcados con fosfatasa
alcalina se unan al complejo de
micropartículas.

Se agrega el sustrato Fosfato 4-


Metil Umbeliferona (MUP) a
la mezcla. Se mide el producto
fluorescente,
metilumbeliferona (MU).
Inmunoensayo por Microparticulas – MEIA
Los resultados de MEIAA se muestran como una curva
Directa por cuanto los valores bajos de analito del paciente
producen una señal más Baja de analitos del paciente dan como
resultado un ensayo muy sensible

Relacion directa

Señal

Concentracion