•Joshua Goklas B B 2314100086 •Syahdan Amir M 2314100090 •M. Aziz Rahmatullah 2314100095 Teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase KROMATOGRAFI gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Keywords
FASE STASIONER FASE GERAK
Fase stasioner adalah komponen penganalisis sample yang posisinya tetap dan tidak bergerak. Material – material penyusun fase stasioner berbentuk padatan inert dan umumnya menempel pada kolom. Contoh dari material fase stasioner misalnya adalah Silica. Fase gerak adalah komponen penganalisis sample yang dapat bergerak secara dinamis dan dapat mengalir. Fase gerak ini dapat pula disebut pelarut. Pelarut yang digunakan dapat berupa senyawa polar atau non polar Contoh pelarut yang digunakan Polar : Air, Metanol Non – Polar : n - Heksana Memadukan sifat Hidrofobik dan Reverse phase Rendahnya polaritas komponen fase chromatography stasioner. Digunakan untuk proses ekstraksi analisa senyawa non – volatil
Size exclusion Memanfaatkan gel berpori untuk
chromatography memisahkan molekul besar dan kecil
Memanfaatkan polaritas fase gerak
High Performance Liquid dan fase stasioner, serta tekanan Chromatography ( HPLC ) dan kecepatan fluida yang tinggi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. HPLC saat ini merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisa bahan obat, baik dalam bulk maupun sediaan farmasetika HPLC ini dapat bekerja melalui 2 fase kerja, yaitu Fase Kerja Normal dan Fase Kerja Balik FASE STASIONER Polar ( ex : Silika ( Si ) )
FASE GERAK / PELARUT Non – Polar
(ex : n- Heksana)
Senyawa-senyawa polar dalam campuran
melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa- senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Non - Polar FASE STASIONER ( ex : Silika termodifikasi)
FASE GERAK / PELARUT Polar
(ex : Methanol)
Secara prinsip kerja, hampir sama dengan Fase
Kerja Normal. Hanya saja pada mekanisme Fase Kerja Balik, senyawa polar lebih cepat melewati kolom dibandingkan dengan senyawa non – polar yang mudah melekat pada kolom ( material fase stasioner ) Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Ada beberapa faktor yang memengaruhi waktu retensi : Tekanan pada pompa Kondisi dari Fase Stasioner ( bahan penyusun, ukuran ) Komposisi pelarut Temperatur pada kolom Jika sinar UV diarahkan pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, maka akan didapatkan langsung berapa besar sinar yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap sangat bergantung pada jumlah partikel terlarut ( konsentrasi ) pada larutan analit Larutan Sejenis
Campuran
Luas daerah dibawah kurva ≈ Jumlah zat
terlarut dalam sample / analit SLIDE TAMBAHAN Reverse phase chromatography alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap. High performance liquid chromatography mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar. Size exclusion chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori Kromatografi HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain: • mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran • mudah melaksanakannya • kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi • dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis • Resolusi yang baik • dapat digunakan bermacam-macam detektor • Kolom dapat digunakan kembali • mudah melakukan "sample recovery" Ambil dua Tablet tambahkan 0,0773 g Fenasetin kocok dengan 10 ml etanol selama 10 menit, clan tambahkan 10 ml ammonium format 0,5 mol dm-3 dan campuran ini diencerkan dengan fase gerak sampat 100 ml. Tablet mengandung bahan-bahan pembawa, maka larutan ini harus disaring sebelum dikromatografi. Dengan kondisi percobaan yang digunakan ketiga senyawa tersebut dapat dipisahkan dalam waktu sekitar 3 menit (lihat Gambar 5.2) Untuk menghitung respons faktor relatif dilakukan penimbangan Standar dari senyawa-senyawa di atas dan diencerkan sehingga konsentrasinya mendekati konsentrasi sampel dan dinjeksikan ke sistem kromatografi sebanyak tiga kali, diperoleh data-data sebagaimana tercantum pada Tabel 5. 2. berikut : Dengan menggunakan Rumus (5b) maka akan diperoleh harga respons faktor relatif, sebagaimana disajikan pada Tabel 5.3. berikut
Kolom :5 silika SCX ; 12,5 cm x 4,6 mm
Fasa gerak :0,05 mol dm-3 HCOONH4 + 10% C2H5OH ; pH 4,8 Kecepatan alir : 2 cm3 min-1 Detektor : uV absorsi, 24 nm Puncak : 1 = Aspirin , 2 = Fenasetin = , 3 = kafein Untuk menghitung kadar aspirin dan kafein dalam tablet, setelah dilakukan Prosedur kerja sebagaimana tercantum pada halaman 26, maka diinjeksi ke sistem kromatografi sebanyak dua kali dan diperoleh data yang disajikan pada Tabel 5.4 berikut : Hitung respons faktor relatif, kadar Aspirin dan Kafein dalam tablet . Persyaratan Farmakope untuk aspirin harus diantara 95% dan 105% sedangkan Kafein di antara 90 % dan 110 % . Apakah tablet tersebut memenuhi persyaratan ? Dengan menggunakn Rumus (5c) maka diperoleh hasil sebgao berikut : Dari Gambar tersebut waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Dengan data ini bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.