Determinación del sexo fetal

mediante ADN libre fetal en

plasma materno.

Álvarez, Jenaro.
Ferreira, Ahinoam.
Germany, Mª Ignacia.
Grandfelt, Gabriela.
14 de Octubre de 2015.
 Objetivo
• Establecer la validez diagnóstica de la identificación del sexo fetal en plasma de
mujeres embarazadas durante la primera mitad del embarazo, mediante medición
de ADN libre fetal (ffDNA) en sangre materna

Referencia utilizada
 Métodos
• Se extrajo sangre periférica:
• 20 ml.
• 25 pacientes.
• Entre las 5 y 15 semanas de gestación.
• Previo consentimiento informado.
– Se separó el plasma mediante
centrifugación.
• ADN genómico total.
– Se analizó por triplicado mediante q-PCR.
• Con partidores específicos para DYS14
– Se diagnosticó el sexo fetal según valores
de ciclo umbral de SYBR Green II.
– Se confirmó mediante ecografías.
• Realizadas entre las 20 y 25 semanas.
 Extracción de sangre
• La recolección de muestras se realizó:
– A pacientes que acudieron a la Unidad de
Medicina Fetal de la Universidad de los Andes.
– Diagnosticadas con embrión único, viable y menor
a 15 semanas.
• Se les extrajo 20 ml de sangre venosa
periférica.
 Procesamiento de muestras
• Centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos.
• El sobrenadante se transfirió a tubos estériles.
– Centrifugandolo durante 10 minutos a 7000 rpm.
• El ADN entonces fue extraído desde 800 µl de plasma
mediante el uso de QIAmp Blood DNA Mini Kit.

https://www.qiagen.com/es/shop/sample-technologies/dna-sample-technologies/genomic-dna/qiaamp-dna-blood-mini-kit/
 Procesamiento de muestras
• El ffDNA (en el plasma materno) se detectó mediante la técnica
de q-PCR.
• Se utilizaron partidores específicos para la secuencia DYS14.
• En la reacción de amplificación de DYS14 se utilizó SYBR Green II.
• El programa consistió en:
– Ciclo de desnaturación inicial a 96º C por 2 minutos.
– 45 ciclos de amplificación (denaturación a 92ºC por 20 segundos.
– Apareamiento a 54ºC por 20 segundos.
– Extensión a 72ºC por 20 segundos
• La fluorecencia de adquirió al final de la fase de extensión.
• La lectura se realizó a 80,5ºC por 5 segundos al final de cada
ciclo.
 PCR en tiempo real
• Técnica que combina la amplificación y
detección en un mismo paso.
• Lo hace correlacionando el producto de la PCR
de cada uno de los ciclos con una señal de
intensidad de fluorescencia .
• Es de alta especificidad.
• Posee un amplio rango de detección.
• Rapidez en la visualización del producto.
 Valores de corte para
asignación del sexo fetal

• En la reacción de amplificación
de DYS14 se utilizó SYBR Green
II, lo cual permite medir durante
la amplificación la cantidad de
ADN sintetizado en cada
momento, ya que la emisión de
fluorescencia producida en la
reacción es proporcional a la
cantidad de ADN formado.
 Resultados
• La probabilidad de diagnosticar el sexo a partir
del test fue de 84%.
• La especificidad y sensibilidad de la técnica
alcanzó un 100%
 Diagnóstico prenatal
• Reúne un conjunto de estrategias para la identificación de
defectos congénitos durante el embarazo.
• Actualmente el diagnóstico de certeza requiere la obtención
de una muestra de material genético fetal mediante técnicas
invasivas como amniocentesis y la biopsia de vellosidades
coriónicas que conlleva riesgos de perdida fetal (~1%).
• Con las técnicas de diagnóstico prenatal no invasivo (NIPD) se
hace referencia a procedimientos que permiten el estudio de
las características genéticas del feto sin acceso directo al
útero, y por lo tanto, sin riesgo de pérdida del embarazo
asociado.
 ADN Fetal Libre
• El material genético fetal puede encontrarse en la circulación
materna en dos formas principales:
• Células fetales intactas:
– Trofoblastos
– Leucocitos
– Eritroblastos primitivos
• ADN fetal libre de células (posee 3 posibles orígenes):
– Apoptosis de células fetales intactas por interacción con el sistema
inmunitario materno.
– Origen placentario, probablemente debido a la apoptosis de las células
trofoblásticas.
– Transferencia directa de ADN.