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Introducción a la

Biología Molecular
Biología Molecular
 Proporciona herramientas moleculares para el
diagnóstico.
 Detecta genomas de patógenos en muestras de
pacientes.
 Caracterizar al agente causal de la enfermedad.
 Comprender mejor los mecanismos patológicos
a nivel molecular.
 ADN es el blanco para el diagnóstico.
Organización del material genético
Dogma Central de la
Biología Molecular

Transcripción Traducción
Replicación ADN ARN Proteína
Molécula de ADN

 Nucleótidos:
 A, T, G, C
◦ pb = pares de bases
◦ Humano: 3 x 109 pb
 Fosfato
 Pentosa
Molécula de
ADN
Estructura del ADN
Biología Molecular
 El principio para el uso de los ácidos nucléicos es
la complementaridad de secuencias entre hebras
independientes que forman espontáneamente
estructuras de doble hélice.

 Adenina - Timina (U si es ARN)


 Guanina - Citosina

 La complementaridad de dos
hebras es la base del uso de
sondas de ácidos nucléicos
Enzimas que afectan al ADN
 Endonucleasas son enzimas que hidrolizan
los enlaces fosfodiéster internos de los
ácidos nucléicos y que lo fragmentan en
oligonucleótidos.
 Exonucleasas son enzimas que hidrolizan
los enlaces fosfodiéster finales de los ácidos
nucléicos, es decir, los de las posiciones 5' y
3' y lo fragmenta en sus nucleótidos
constituyentes
 Endonucleasas de restricción son
endonucleasas que se fijan sobre sitios
palíndromos. Ej. GAATTC
CTTAAG
Enzimas de Restricción

• Estas nucleasas de restricción


rompen el ADN reconociendo
secuencias específicas .
• Generan los mismos fragmentos
en un ADN determinado.
• Se conocen más de 100
endonucleasas de restricción
distintas, cada una de las cuales
rompe en una secuencia diferente.
Endonucleasas
Existen tres tipos:
Tipo I cortan de forma inespecífica en un punto que
dista de la secuencia de reconocimiento alrededor de
1000 pb

Tipo III, también es inespecífica, corta en un punto más


cercano de la secuencia que las del tipo I, a unos 25pb.
•Tanto I como III requieren energía a partir de ATP.

Tipo II son las más utilizadas. No requieren ATP y


cortan específicamente en la secuencia de
reconocimiento.
Introducción a la
Biología Molecular

Análisis de ADN
Análisis de ADN
Extracción de ADN
Etapas:
 Pasos necesarios para una correcta
extracción y purificación del ADN
mediante un procedimiento químico
son:
 Lisis de las células o virus
 Degradación de la fracción
proteica asociada al ADN
 Purificación
Extracción de ADN:
Lisis de las células
 Consiste en romper las estructuras que
confinan el citoplasma y liberar al medio
su contenido.
 Debe romperse la estructura
tridimensional de macromoléculas como
las proteínas o los ácidos nucléicos con
sales.
 La adición de un detergente como el
SDS se utiliza para eliminar las
membranas.
Extracción de ADN:
Métodos de Lisis celular
 Entre los métodos para la liberación de los
ácidos nucléicos se encuentran:
 Hervir en agua destilada o tampón de
PCR
 Uso de detergentes con o sin calor
 Hidróxido sódico con calor
 Ciclos de congelación - descongelación
 SDS - proteinasa K
 Ácido perclórico
 Enzimas (lisozima)
 Sonicación
Extracción de ADN:
Degradación de la fracción
proteica asociada al ADN

 Se consigue mediante la adición de


una proteasa.
 La fracción proteica puede
precipitarse mejor con la ayuda de
sales como el acetato de amonio o el
acetato sódico.
Extracción de ADN:
Purificación
 Implica la retirada de la solución final
de la mayoría de elementos que
pueden interferir en la prueba.

Fases:
 Precipitación del ADN
 Lavado del “pellet”
 Recuperación
Extracción de ADN:
Purificación

 Precipitación del ADN


 El ADN es insoluble en alcohol, por lo
que se puede precipitar en etanol frío
o isopropanol y recuperar mediante
una centrifugación.
 El alcohol del sobrenadante se llevará
las sales añadidas previamente.
Extracción de ADN:

 Lavado del “pellet”


 Se realiza con alcohol frío volviendo a
centrifugarse

 Recuperación
 El sedimento se puede resuspender
en agua o tampón Tris tras ser secado
completamente.
Extracción de ADN
Extracción de ADN:

Confirmación de la presencia de ADN


se lleva a cabo mediante:
 electroforesis en un gel de agarosa
 tinción con bromuro de etidio
 observación con luz UV
 al espectrofotómetro mediante
espectro de absorción de 260 nm.
Extracción de ADN:
Purificación
 Minicolumnas equipadas
con una membrana de
sílica que retiene específicamente el
ADN permitiendo el paso de las
moléculas y sales que acompañan la
reacción de lisis.
 Se lava con alcohol y se eluye el
contenido.
EXTRACCIÓN DEL ARN
(Sndas TaqMan de captura)

Lisis y estabilización Hibridización Captura Lavado

Ruptura del virus o Adherir la sonda con


célula para liberar el blanco a la perla
Ac. Nucléicos Partícula
magnética
Adherir sonda Sonda (perla)
RNA blanco al blanco biotinizada recubierta
con
(virus)
streptovidina
Magneto

Virus o célula

T° de incubación 60°C T° de incubación 37°C


Introducción a la
Biología Molecular

Métodos de
Detección de ADN
Métodos de detección de ADN

 Hibridación con sondas de ADN


 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Sondas de ADN

 Secuencias que hibridan exclusivamente con secuencia


de ADN específicas de los organismos causantes de la
enfermedad.
 Deben ser relativamente cortas para evitar reacciones
inespecíficas que resulten en diagnósticos falsos
positivos.
 No deben reaccionar con ninguna secuencia del ser
humano o de otros organismos no patógenos de la flora
natural del mismo.
 Poseen alta especificidad.
 Su desventaja es que requieren de una cantidad
elevada de ADN
Hibridación con Sondas específicas de ADN
 Consiste en la unión de una sonda de ADN con secuencias
complementarias.
 La detección del híbrido formado es indirecta.
◦ radiación
◦ quimioluminiscencia
◦ sustancia cromógena
Diagnóstico por
Southern blot
e hibridación con
sondas específicas
Hibridación con Sondas específicas de ADN

Sonda multilocus o MLP:


sonda que reconoce una secuencia
en común de VNTR; revela una pauta
de distribución de fragmentos de ADN
semejante a un código de barras.

Sonda unilocus o SLP:


sonda que reconoce la secuencia
específica de un locus dado; sólo se
observan dos bandas
correspondientes al minisatélite
específico, una del alelo materno y la
otra del paterno.
Detección de la Molécula de ADN
SYBR-GREEN
Moléculas fluorescentes que se intercalan
en el ADN de cadena doble.
SYBR Green
Detección de la Molécula de ADN
Sondas “Beacons"
 Cebadores fluorescentes.
 La molécula fluorescente y la molécula que absorbe la
fluorescencia se mantienen próximas mediante la formación de
una horquilla de hibridación.
 La horquilla se abre durante la amplificación, aumentando la
emisión de fluorescencia.
Detección de la Molécula de ADN
Sondas Taqman
 Hacen uso de la actividad 5‘ exonucleasa de la Taq DNA
polimerasa.
 Poseen un marcador fluorescente en el extremo 5'
 Y una molécula que absorbe ("quencher") la fluorescencia
emitida por el marcador en el otro extremo.
La sonda hibrida con el fragmento específico y, a medida que se
sintetiza la hebra complementaria al fragmento, la sonda se va
degradando por la acción exonucleasa, liberando el marcador que
emite fluorescencia.
Sonda
TaqMan

Doble cadena de ADN

dNTPs

Cebadores de PCR

Sonda Taqman

Reportero “Quencher”

Fuente de luz del instrumento

Fluorescencia emitida por el


Reportero
Introducción a la
Biología Molecular

PCR
PCR
 Reacción en Cadena de la Polimerasa
 Consiste en amplificar selectivamente
una secuencia del genoma.
 Es una amplificación de
ADN in vitro
 Se utilizan cebadores
específicos
 La duplicación de la
secuencia blanco ocurre
de una manera exponencial
 Se utilizan termocicladores
PCR: Componentes
 Tampón o “Buffer” de amplificación
 Contienen KCl, Tris y MgCl2
 Cebadores o “Primers”
 complementarios a cada uno de los extremos 3‘
 Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)
 Taq-polimerasa
 Polimerasa resistente a las altas temperaturas
 Aislada de la bacteria Thermus aquaticus
 ADN muestra
 Corresponde al analito
Cebadores o “Primers”

• Secuencias de ADN utilizadas como


iniciadores de la duplicación.
• Son reconocidos por la polimerasa
para poder comenzar la duplicación.
PCR
Inhibidores de la PCR
 Se trata de substancias que interfieren con las ADN
polimerasas termoestables ya sea mediante:
 el bloqueo directo total o parcial de su
actividad catalítica o
 la unión directa al ADN de doble cadena
 Ejemplo, algunas substancias interaccionan con los
iones Mg2+(un cofactor crítico de la actividad
catalítica) o disminuyen su disponibilidad pudiendo
inhibir la PCR.
ETAPAS
DE LA PCR
Iniciación

Cebador
Alineamiento
Cebador

Elongación

Extensión
PCR
PCR

 Tipos:
 PCR convencional
 PCR en Tiempo Real
 RT- PCR
PCR
Convencional

 El ADN extraído son examinadas


con cebadores diagnóstico.
 Fragmentos de ADN amplificados
son analizados por electroforesis
sobre gel de agarosa.
Preparación del Gel de Agarosa

Molde
Peinilla
Equipo de Electroforesis para ADN
Cámara de Electroforesis para ADN
Transiluminador
Fotografía

Cámara Polaroid
Fotodocumentador
Electroforesis de ADN
PCR
en Tiempo Real
 Los equipos de amplificación llevan
incorporados un sistema de detección de
fluorescencia.
 Se utilizan moléculas específicas
denominadas fluoróforos y quenchers.
 La amplificación de ADN es monitoreada,
en tiempo real, midiendo la señal de
fluorescencia generada en el tubo de
reacción.
Analizador
COBAS
TaqMan 48
PCR en
Tiempo
Real
PCR en
Tiempo Real
PCR
en Tiempo Real
 La señal de fluorescencia es medida en cada ciclo
de amplificación y es proporcional a la cantidad de
producto de PCR acumulado.
 Para la detección por fluorescencia se utiliza:
 SYBR Green (tinte de unión al ADN )
 Sondas TaqMan secuencia específica
 Se sustituyen los pasos de electroforesis y análisis
de imagen de una PCR convencional.
Curvas de Crecimiento correspondientes al ARN de interés para una
serie de diluciones que abarca un intervalo de 5 unidades Log 10

Fluorescencia normalizada

Titulo
más alto

Titulo
más bajo

Número de ciclos
PCR en tiempo real utilizando sondasTaqMan

(1) Sonda marcada, el fluoróforo reportero es bloqueado debido a la transferencia de


energía por resonancia (FRET).
(2) La sonda y la hebra de cDNA son hibridizadas; el fluoróforo reportero se
encuentra bloqueado.
(3) Durante la PCR, el extremo 5’ de la sonda es degradado por la Taq polimerasa.
El fluorocromo es liberado.
PCR
en Tiempo Real: Ct
 Denominado como Ciclo Umbral (Ct), que
se define como el ciclo a partir del cual la
fluorescencia es estadísticamente
significativa por encima del ruido de fondo
(background).

 El Ct es un parámetro en función del cual


se realizan todos los cálculos analíticos y
obtención de resultados.
Normalización del Valor de Fluorescencia en Cada Ciclo para
Cada Curva de Crecimiento

Valor de Fluorescencia Valor Ct = 27.1


Fluorescencia normalizada

asignado

Número de ciclos

Ct = valor umbral crítico


PCR
en Tiempo Real: Ct
 Propiedades del parámetro Ct:
 Separa los datos del ruido de
fondo.
 Determina el ciclo inicial de
amplificación.
 Es inversamente proporcional al
número de copias iniciales del
molde
RT - PCR
 Cuantificación de ARN por PCR a
tiempo real.
 El molde inicial es ARN.
 Mediante la retrotranscriptasa
(transcriptasa reversa) se obtiene el
ADNc.
 Este ADNc es posteriormente
amplificado.
Amplificación del cDNA por PCR en TIEMPO REAL

Desnaturalización
a del DNA por calor Alineación del Primer y
de la Sonda
Crecimiento
Exponencial
del DNA
Primer Reportero
directo fluorescente
Bloqueador Primer
Polimerasa (quencher) reverso
Z05

DNA Sonda de DNA Sonda de DNA


viral HIV especifica control
especifica
DNA
control Extensión del DNA
Primer e hidrólisis control
de la Sonda

Ciclos
subsecuentes
de PCR

inmunopaedia.org
PCR
 Si
es necesaria proseguir una
caracterización, los fragmentos
amplificados por PCR pueden ser
analizados mediante:
 Polimorfismos en la Longitud de
los Fragmentos de Restricción
(RFLP)
 Secuenciación del ADN
Secuenciación de ADN