INTRODUCCIÓN

¿Qué es el ADN - Recombinante?

Creación de nuevas combinaciones de segmentos o de

moléculas de DNA que no se encuentran juntas de
manera natural. Término reservado a moléculas de DNA
producidas por la unión de segmentos que provienen de
diferentes fuentes biológicas. Asimismo, una secuencia
determinada de DNA se puede aparear con otra
secuencia complementaria ya sea de DNA o de RNA
(hibridar).
 Protocolo de construcción de un rDNA

Identificación del gen de interés

(Organismo donante)

Corte con ER

( DNA no homólogo) Inserto + Vehículo o vector (rDNA quimérico)

Clonación del gen de interés en bacterias

Modificación del Donante

Reintroducción del gen en células donantes originales

 Pasos que incluye los procedimientos básicos

1. Generación de fragmentos de DNA con edonucleasas

2. Fragmentos producto de la digestión se unen a vectores, que
pueden replicarse de forma autónoma en la célula huésped
3. La molécula de rDNA formada por un vector que lleva el inserto, se
transfiere a una célula huésped. Aquí la molécula de rDNA se
replica, produciendo docenas de copias: Clones
4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan
el rDNA, creándose una población de células idénticas, que llevan
todas la secuencia clonada
5. Los segmentos clonados pueden recuperarse del huésped,
purificarse y analizarse
6. El DNA clonado puede transcribir su mRNA, traducirse y el producto
génico aislarse y examinarse.
 Fabricación del rDNA

ENZIMAS DE RESTRICCION: Endonucleasas,

aisladas de bacterias.
1. limitan o previenen infecciones víricas,
degradando el ácido nucleico invasor.
2. Reconocen una secuencia de nucleótidos
específica y lo cortan
3. Se denominan según el organismo en el que
se descubrieron, utilizando un sistema
alfanumérico
4. Ejm. EcoRI ( Escherichia coli), HindIII
(Hemophilus influenzae)
 Fabricación del rDNA
ENZIMAS DE RESTRICCION.
5. Hay dos tipos de enzimas: I y II
6. Tipo I: cortan las dos cadenas de DNA en posición
aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción, no
son utilizadas en investigación de rDNA
7. Tipo II: reconocen secuencia específica y cortan las
dos cadenas de DNA con precisión.
8. Las secuencias reconocidas por enzimas tipo II son
simétricas: Palindromos
9. EcoRI, corta escalonada, dejando extremos de
cadena sencilla “cola pegajosa”, otra como SmaI corta
formando extremos romos, necesitando la enzima
desoxinucleotidil transferasa terminal, para crear
extremos de cadena sencilla.
 DNA eucariótico DNA plasmídico

C–C–C G–G–C

G– G – G C–C–C
Adición de colas de poli-dT Desoxinucleotidil
transferasa terminal Adición de colas de poli-dA

C–C–C A–A–A–G–G–C

G– G – G –T – T – T C–C–C

C–C–C A–A–A–G–G–C
Unión de
los fragmentos

G– G – G –T – T – T C–C–C

Ligación con DNA ligas

C–C–C-A–A–A–G–G–C

G– G – G –T – T – T - C – C – C
Las moléculas de rDNA pueden formarse a partir de DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos. La desoxinucleotidil
transferasa terminal crea colas complementarias, mediante la adición de fragmentos de poli dA y polidT
 Digestión del DNA
•ER como mecanismo de defensa (fagos)
•Corte en secuencias DIANA
•Eco RI: en escalera:

5’…G A A T T C …3
3’…C T T A A G…5’’
•Si dos moléculas de DNA se cortan con la misma
enzima, ambas producen los mismos extremos
cohesivos complementarios: quimeras

La Enzima de restricción de EcoRI corta una molécula

circuar de DNA, con un solo sitio de reconocimiento,
dando lugar a una molécula lineal con extremos
cohesivos
 Clonación de un gen específico

ELECCION DEL VECTOR DE

CLONACIÓN
* Vectores moleculares pequeños
* Capaz de proliferar
* Que contenga sitios de restricción
* Que ofrezca mecanismos de
identificación y recuperación de
moléculas recombinantes
 VECTORES
El vector es un vehículo de clonación, son
moléculas de DNA transportadoras, que tiene las
siguientes características:
1. Debe replicarse independientemente junto con el
segmento de DNA que transporta
2. Debe contener sitios de corte, presentes sólo
una vez en el vector
3. Debe tener algún marcador de selección
(normalmente genes de resistencia) para poder
distinguir lasa células huésped que transportan el
vector de las que no lo contienen
4. El vector de la célula huésped debería ser fácil
de recuperar
 VECTORES: Plásmidos

Moléculas de DNA de doble cadena,

extracromosómicas de origen natural, que tiene las
siguientes características:
1. Origen de replicación (ori+)
2. Replicación autónoma en la bacteria
3. Número limitado de sitios de restricción
4. Genes de resistencia a antibióticos específicos
5. Vector pBR322, primero utilizado en rDNA
Method for generating a recombinant DNA plasmid
containing genes derived from donor DNA.
 Plasmido pUC18
Deriva del pBR322 y tiene siguientes
características:
1. Tiene la mita de tamaño que el pBR322, lo que
permite insertar fragmentos de DNA más largos
2. Se replica produciendo unas 500 copias por
célula, lo que significa unas 5 ó 10 veces más que
las que produce el PBR322
3. Tiene un gran número de sitios de restricción:
sitio de clonación múltiple (polylinker)
4. Tiene un fragmento de un gen bacteriano
denominado lacZ, que codifica b-galactosidasa,
enzima que corta moléculas de azucar. Cuando el PUC18
se introduce en la célula bacteriana , se produce b-galactosidasa funcional.
 La inserción en pBR322 se
detecta por inactivación de un
gen de resistencia a
tetraciclina (tetR), que
provoca el fenotipo de
sensibilidad tetS. La inserción
en pUC18 se detecta por
inactivación de la función b
galactosidasa del gen Z’, que
provoca incapacidad para
covertir el sustrato artificial X-
Gal en un compuesto azul

Esquema de la estructura general y sitios de

restricción de los vectores pBR322 y pUC18
 Bacteriófagos lamba
El tercio central de su genoma es prescindible y puede
reemplazrse por DNA exógeno sin afectar la capacidad
infectante del fago.
Empaquetan cromosomas de unos 50 kb de
longitud.

El DNA exógeno a ser insertado debe ser cortado con la

misma enzima que la que se utiliza para cortar el
genoma viral
Utilización de transfección para introducción a célula
huésped
Otros bacteriofagos utilizados: M13
COSMIDOS : vectores híbridos (Lambda + plásmido); * clonación de
insertos de DNA 3 veces + grandes que lambda
Se corta el cósmido en
un sitio BglII adyacente
en el sitio cos. El DNA
genómico donante se
corta con Sau3A, que
produce extremos
cohesivos compatibles
con BglII. Cuando se
mezclan, se obtienen
moléculas de DNA
donante y vector
dispuestas en tandem.
El fago se empaqueta
in vitro mediante la
introducción de cortes
en los sitios cos. Los
cósmidos que
contienen inserto, una
vez dentro de las
células bacterianas, se
convierten en
moléculas circulares
CLONACION EN COSMIDOS
 Construcción de una genoteca

Muestra DNA
Obtener colección Clones (genoteca de DNA) (clonación
en perdigonada) clon blanco?
Tipos de genotecas:
a. Según vector utilizado (Plásmido, Fago, Cósmidos,
YAC, BAC)
b. Según origen del DNA
• Construcción de genotecas de cDNA (carece de
secuencias reguladoras e intrones) (tr. Inversa)
• Una genoteca de cDNA está constituída por regiones
que se transcriben, por lo tanto es más pequeña que
una genoteca completa.