ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Secuencias de
Sitio de corte reconocimiento Sitio de corte

ADN
cromosómico

Extrem os s Extremos romos

cohesivo

ADN
Liga a
s
Vector de clonación
digerido con EcoRI y
PvuII
Tipos de enzimas de restricción

Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de

corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
Restricción-modificación

m
EcoR G-A-A-T-
I T-C G-A-A-T-T-C
C-T-T-A- C-T-T-A-A-G
m A-G EcoRI
G-A-A-T- m
T-C G-A-A-T-T-C
C-T-T-A- C-T-T-A-A-G
A-G
m
G A-A-T-T-C
EcoRI
C-T-T-A-A G
m
G-A-A-T-
T-C
C-T-T-A-
La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la
regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de
restricción específicas permite distinguir entre ADN metilado y no
metilado, obteniéndose de esta manera información sobre la posible
regulación de la expresión de un gen por metilación del ADN

Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-

metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la
transcripción.
HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG

Plantas: metilación m5CG y m5CNG.

Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:
McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA
sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
Metilación del ADN y digestión con enzimas de restricción

Sistema dam: metila la A de la secuencia GATC en el N6, generando

6-metiladenina: Gm6ATC.
PvuI, BamHI, BclI, BglII, XhoII, MboI y Sau3AI (/GATC)
ClaI: AT/CG*AT
XbaI: T/CTAG*A

Sistema dcm: metila la C interna de la secuencia CC(A/T)GG en el C5, generando

5-metilcitosina: Cm5CWGG
EcoRII: /CCWGG, BstNI: CC/WGG
StuI: AGG/C*CT

DpnI: Es una enzima de restricción que corta en la secuencia GATC sólo si está
metilada por dam (Gm6ATC). Utilizada en algunos protocolos de PCR para eliminar
ADN plasmídico proveniente de la bacteria sin afectar al sintetizado in vitro.
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

• Reconocen secuencias
concretas
• Simetría (palíndromes)
 Ejemplos de palíndromes

• Dabale arroz a la zorra el abad

• La ruta natural
• A man, a plan, a canal: Panama
 Enzimas de restricción
• Reconocen secuencias concretas
• Simetría (palíndromes)
• Número de nucleótidos en la secuencia

N1N2N3N4 N1 N2 N3 N4 N5 N 6 N1 N2 N3 N4 N 5 N6 N7 N 8

44 46 48
256 4096 65536
Sitios de corte de las endonucleasas de
restricción del tipo II

Tipo IIs: MboII

 Extremos protuberantes
5’
protuberantes
EcoRI G-3’
CTTAA-5’
GAATTC

CTTAAG
5’-AATTC
3’-G
 Extremos protuberantes
3’
protuberantes

CTGCA-3’
PstI G-5’

CTGC
AG 5’-G
GACGTC 3’-GACGTC
 Extremos romos

SmaI CCC-3’
GGG-5’
CCCGGG

GGGCCC 5’-GGG
3’-CCC
Extremos compatibles (I)

EcoRI
GAATTC

CTTAAG GAATTC
EcoRI
CTTAAG
GAATTC

CTTAAG
Extremos compatibles (II)

SalI
GTCGAC

CAGCTG GTCGAG
XhoI
CAGCTC
CTCGAG

GAGCTC
 Extremos romos
(siempre compatibles)
SmaI
CCCGGG

GGGCCC CCCATC
EcoRV
GGGTAG
GATATC

CTATAG
 Extremos no compatibles rellenados,
transformados en romos
(siempre compatibles)

EcoRI
GAATTC GAATT-3’
-3’
CTTAA-5’
CTTAAG GAATTTCGAG
XhoI + dNTPs
CTCGAG 5’-TCGAG CTTAAAGCTC
3’-AGCTC
3’-
GAGCTC
•Degradado de cadena sencilla
 Extremos no compatibles
transformados en compatibles
• Rellenado parcial
HindIII
AAGCTT AAG-3’
-3’
TTCGA-5’
TTCGAA AAGCTAGA
XbaI + dATP, + dGTP
TCTAGA 5’-CTAGA TTCGATCC
3’-TCC
3’-
AGATCT
+ dCTP, + dTTP
 Precauciones

• Actividad “star”

• Metilación
 Aspectos prácticos

Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 g de ADN en 1 hora a la

temperatura y condiciones óptimas.

Inhibición: Adición de 20 mM EDTA.

Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA

Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre

que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,
concentración de sales)