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PROBLEMAS

FERMENTATIVOS: Paralización
de fermentaciones
FACTORES DE ESTRES
 La paralización de fermentaciones se producen por
estados de estrés que sufren las levaduras en las etapas
de su producción como inóculos y durante su manejo
en las etapas de aplicación industrial.

 Las causas de estrés son muy variadas y están
relacionadas con un amplio numero de factores que
afectan las estructuras y el metabolismo celular.

 De la mayoría de estos factores de estrés no se conoce


bien su causa precisa.
Antecedentes generales

• La utilización de levaduras seleccionadas hace


necesario contar con métodos de conservación de
cepas y producción de biomasa
• Las condiciones de conservación y de aumento de la
biomasa, afectan las características de los inóculos.
• Las etapas antes señaladas pueden provocar en las
levaduras fenómenos de estrés que afectan su
comportamiento como inóculos
ESTRES PRESENTES DURANTE LA
PRODUCCION DE LEVADURAS

Periodo de Conservación
 Al trabajar con cepas seleccionadas es imprescindible conservar
las cepas de una temporada a otra.
 La conservación debe hacerse sin que se produzcan
modificaciones de sus características fisiológicas y metabólicas
 Las condiciones de conservación de las cepas seleccionadas,
pueden producir estados de estrés y con ello modificar las
características de las cepas.
Producción de LSA
• La forma general de comercializar levaduras es
como levaduras secas activas (LSA).
• La forma en que se obtienen, condiciona su
comportamiento fermentativo
• Existen cepas de levaduras que no pueden
producirse industrialmente, ya que no toleran
alguna de las etapas del proceso de producción
• Hace falta un mayor desarrollo en este aspecto
Etapas de producción de LSA
• Activación de las cepas del cepario
• Inoculación en el medio nutritivo
• Regulación de las condiciones de crecimiento
• Recuperación de la biomasa por centrifugación
• Eliminación de agua por extrusión
• Secado en flujo laminar
Activación de levaduras secas
activas
 No se dispone de muchas datos sobre los efectos de esta
etapa, pero el sentido común indica que las células
experimentan un intenso estres debido a :
 Choque hipo osmótico
 estrés por temperatura.
 La célula puede defenderse de manera muy limitada ya
que su metabolismo es muy bajo por la falta de agua
libre baja disponibilidad de nutrientes
 La respuesta de las células a estos efectos depende de las
condiciones adquiridas antes del secado.
 Es critico haber creado condiciones de resistencia al
estrés antes de la etapa de secado
Condiciones de la activación
• Disminuir el choque hipo-osmótico elevando la
presión osmótica del liquido de hidratación :
Mezcla de agua con mosto bien agua con unos 10
a 20 g/L de azúcar.
• No agitar violentamente en la primera etapa de la
hidratación, las paredes de las células son muy
frágiles debido a su elevada desecación.
• Buena regulación de la temperatura
Estrés en la inoculación del mosto
 Cuando se inocula la levadura en el mosto, sufre
un shock hipertónico (pierde agua)
 La célula responde modificando la estructura de la
pared y del citoplasma
 La principal modificación citoplasmática es un
aumento de la concentración de glicerol y de otros
osmolitos (iones potasio, aminoácidos, azúcares,
alcoholes)
 Para resistir mejor este efecto se han desarrollado
levaduras superproductoras de glicerol (son cepas
transgénicas).
Control del estrés
• Se debe aumentar de manera paulatina la concentración
de soluto en el medio de activación del inoculo
• Una recomendación es mezclar en tres paso sucesivos
igual volumen del medio de activación y de mosto,
esperando unos 30 minutos entre paso y paso
• Se debe tener presente las diferencias de temperatura
del medio de activación y del mosto
Al mezclar, el salto térmico no debería ser mayor
a los de 5 °C.
ESTRES PRESENTES DURANTE
LA FERMENTACION
Principales causales de represiones de
la actividad fermentativa

M
Limitación
nutricional
Mi
Causas de estrés

 Elevada variabilidad del medio fermentativo


 La variabilidad se ve afectada por la
composición inicial y los cambios permanentes
durante la evolución de la fermentación
 La levadura durante la fermentación debe
modular los regímenes de transporte de
compuestos nitrogenados y azúcares
Mecanismos de control del estrés
 La célula debe activar variados mecanismos de
control de estrés durante las etapas iniciales de
la fermentación
 Síntesis de proteínas de estrés
 Síntesis de compuestos osmo-activos
 Síntesis de trealosa para regular choque
osmóticos y responder a los efectos del etanol.
 Debe acumular glicógeno en condiciones de
deficiencia de azúcares
PARALIZACION DE
FERMENTACIONES

Aspectos nutricionales y
fisiológicos
Estrés producidos por condiciones
nutricionales
Los factores de estrés relacionados con el aspecto nutricional pueden
clasificarse en:
 Los que afectan la proliferación y el crecimiento celular
 Los que afectan la actividad metabólica en fase estacionaria no
proliferante

Estas dos categorías no son necesariamente excluyentes

Los factores menos estudiados se relacionan con la fase estacionaria. En


ella destacan
 Fallas en la disponibilidad de una fuente de energía
 Fallas en la disponibilidad de aminoácidos para la sustitución de proteínas
degradadas
 Deficiencias de compuestos necesarios para minimizar los efectos del
etanol en la membrana (factores de sobrevida)
Alteraciones de los mecanismos de
transporte
Aspectos relacionados con la acción de
los transportadores
 Los transportadores para su funcionamiento normal deben cambiar de
conformación. Por ese mecanismo vuelcan los sustratos al interior de la célula
 La modificación se hace difícil cuando la membrana es muy rígida
 Los cambios de la conformación se favorecen con la mayor presencia de
ácido grasos insaturados en la membrana
 La perdida de actividad de los transportadores se ha establecido como el
principal factor de la detención de la fermentación
 La suplementación de algunos aminoácidos en la fase estacionaria ha
demostrado que tiene un efecto en la prolongación de la actividad
fermentativa, no así las adiciones de nitrógeno amoniacal.
Alteraciones en el flujo de transporte
de azúcares
 La estructura del mecanismo de transporte es muy compleja
 Participan 18 genes de estructura similar que codifican igual numero de proteínas
 El transporte de los azúcares se hace por un acción acumulativa de más de un
transportador
 El transporte de azúcares se hace por transportadores de baja y alta afinidad
 Los transportadores de alta afinidad son inhibidos por elevadas concentraciones de
azucares; funcionan a bajas concentraciones de sustrato
 La sucesión de los transportadores es un evento critico
 Los transportadores de azucares presentan una elevada tasa de recambio en células
en fase estacionaria, por ello para su síntesis se necesita un constante aporte de
nitrógeno.
Variaciones en la velocidad de transporte
intracelular de glucosa en función de su
concentración en el mosto
Efectos de las concentraciones
elevadas de etanol
• Represión de los mecanismos de transporte activo a
través de la membrana
• Inhibe el bombeo activo de protones asistido
energéticamente por la ATPasa de la membrana.
• El etanol también desactiva la GAP por
modificación de su parte proteica.
• Altera la selectividad de las membranas celulares.
Efecto del etanol en la membrana
El etanol produce una
MOSTO CITOPLASMA
perdida de la selectividad
frente a los protones
externos y provoca un
ingreso pasivo de

Alto Etanol
protones a la célula.

Plasmalema
La difusión facilitada de
aminoácidos es
fuertemente inhibida por el
etanol (compite con la
difusión pasiva de
protones).
Efectos citoplasmáticos causados por el
etanol: posibles factores de resistencia
 Las alteraciones no solo provocan estrés a nivel de la membrana
 La acumulación intracelular de etanol provoca alteraciones
citoplasmáticas que modifican el estado iónico de las proteínas y
como resultado su conformación.
 Se observan cambios en la viscosidad del citoplasma
 La síntesis de trealosa es un mecanismo de protección frente a estos
efectos
 Las disponibilidades de glicina en el mosto al parecer actúa en el
mismo sentido. Este aminoácido es deficiente en mostos de elevada
madurez y en mostos con ataques de Botrytis.
Efecto de las concentraciones intracelulares de
trealosa sobre la viabilidad de la levadura

Trealosa (µg/mg de peso seco)


Viabilidad %
Efecto de la disponibilidad de
oxígeno molecular
• Imprescindible para síntesis de lípidos de las
membranas
• Anaerobiosis estricta detiene la reproducción celular
• Pequeñas concentraciones de oxígeno estimulan las
células jóvenes, no a las de más edad
• La anaerobiosis produce un mayor rendimiento en
etanol y menor concentración (estado estacionario) de
subproductos
• La disponibilidad de oxígeno tiene efecto sobre la
asimilación del amonio adicionado.
Estrés debidas a temperaturas
extremas
 Las temperaturas afectan el comportamiento de los transportes
a través de la membrana
 La temperatura afecta la fluidez de la membrana al modificar
la viscosidad de los ácidos grasos.
 Las bajas temperatura disminuyen la fluidez y restringen los
cambios de la conformación de los transportadores.
 Las temperaturas elevadas alteran la asociación entre el
transportador y la membrana, afectan también el cambio de su
conformación.
 Los efectos son muy semejantes a los del etanol por ello las
acciones están correlacionadas. Sobre todo en el rango alto
Estrés por temperaturas extremas (II)

 Los cambios abruptos de temperatura también afectan


a las enzimas citoplasmáticas y con ello el
funcionamiento de los organelos subcelulares.
 Los cambios drásticos de temperaturas generan la
expresión de genes que sintetizan proteínas de estrés.
 La posibilidad de las células de sintetizar estas
proteínas en la fase estacionaria es clave para
enfrentar los cambios drásticos en el medio.
 Si los cambios de temperatura ocurren en condiciones
de limitaciones nutricionales, las célula pueden no ser
capaz de compensar los efectos del estrés.
Efecto de las competencias
microbiológicas
 Las fermentaciones lentas o las inoculaciones tardías permiten el
desarrollo de poblaciones de levaduras no Saccharomyces y
bacterias lacticas
 Existen cepas que son muy sensibles al desarrollo de bacterias
lácticas en el mosto.
 Los mostos en los que ha ocurrido un desarrollo de bacterias
requieren el aporte de cantidades superiores de vitaminas.
 En California una bacteria identificada como Lactobacillus
kunkeei, ha causado graves paralizaciones de fermentación en
función de las cepas de levadura que se trate.
 Las inhibiciones cruzadas son bastante específicas por ello se cree
que no deberían tener gran importancia industrial. Eso si es
necesario conocerlas para evitarlas
Efecto de las concentración de
sólidos en suspensión
• Los estudio han determinado que la cantidad de sólidos
y coloides en suspensión afectan la porosidad de pared
celular.

• Al comparar un mosto con 380 NTU frente a otro de


34 NTU, se observó que la menor turbidez provoca un
aumento de porosidad de la pared celular en la fase
estacionaria del crecimiento poblacional.
Razones para el efecto
• La mayor porosidad de la pared permite la perdida
de macromoleculas desde la célula lo que debe
afectar el comportamiento metabólico de las
mismas.
• Por otra parte los mostos con mayor cantidad de
sólidos permiten una mejor eliminación del CO2
del tanque de fermentación, moderando los efectos
restrictivos que produce su acumulación.
Sólidos suspendidos y activación
• Son variados los materiales que se han testeados
para evaluar su comportamiento activador de la
fermentación en mostos muy limpios.
– Celulosa microcristalina
– Paredes de levaduras
– Bentonita
– Tierras de diatomeas
• En otras industrias también se han obtenido datos
semejantes: ejemplos son la industria de la
cerveza, whisky y del ron.
Presencia de ácido acético
• Las elevadas presiones osmóticas del medio
fermentativo provoca modificaciones metabólicas
que generan concentraciones mas elevadas de ác.
acético.
• El ácido acético es un ácido débil que por estar
poco disociado en el vino puede traspasar las
membranas de las células provocando una fuerte
restricción metabólica por acidificación del
citoplasma)
 La presencia de ácido acético reduce severamente
la capacidad de Saccharomyces para utilizar y
retener tiamina.
Mejoramientos de interés industrial
• Moderar la eficiencia fermentativa
• Mejorar el metabolismo del nitrógeno y del azufre
• Aumento de la resistencia al grado alcohólico
• Tolerancia a bajas temperaturas de fermentación
• Producción de enzimas extracelulares
• Desarrollo de cepas con actividad antimicrobiana
(factor killer y otros)
Fermentación y levaduras saludables
Aspectos nutricionales
– Fuentes
– Nutrición integral
– Reconocimiento de diferencias entre cepas
• Momento de aplicación de los complementos
nutricionales
• Control de las bacterias lácticas (uso de lizosima)
• Aporte de oxigeno
Principales requerimientos
nutricionales
• Nitrógeno asimilable por la levadura (YAN)
– Orgánico simple
– Orgánico complejo
• Micronutrientes
– Vitaminas
– Minerales
Micronutrientes de importancia
Mejor crecimiento celular
Tiamina Menos producción de acetaldehído
Menor síntesis de acidez volátil

Efecto sinérgico con el nitrógeno


Mejora la cinética de la FA
Biotina Aumenta la producción de esteres
Mejora la viabilidad el final de FA

Mejora la cinética fermentativa


Pantotenato Disminuye la producción de acetaldehído
Disminuye la formación de compuestos
azufrados y de acides volátil

Inositol Esencial para la formación de


fosfolípidos de membrana
Estrés producidos por deficiencia de
tiamina
 Recientemente se ha demostrado que
Kloeckera es muy eficiente en la absorción
de tiamina del mosto esto deja el mosto
deficiente para las necesidades de
Saccharomyces.
De manera complementaria el SO2 reacciona
con la tiamina reduciendo su disponibilidad.
 Estos factores pueden actuar de manera
sinérgica en mostos con decantación estática
que permitan el desarrollo de levaduras del
genero Kloeckera.
Micronutrientes Minerales
mejora resistencia al etanol temperatura y choque
Magnesio osmotico, aumenta el rendimeiento en etanol ,
relacion necasaria Ca:Mg < 1

cofactor enzymatico de la glicolisissis,


Zinc incrementa la tolerancia al alcohol regulacion
en la produccion de productos secundarios de
la FA (esteres, alcohols, acidos grasos)

Efecto sinérgico con el Zn,


Manganeso Disminuye los tiempos de generación (tiempo
entre dis reproducciones)

elemento esencial, pero toxico sobre 1-2 mg/L


Cobre
Debe estar sobre los 300 mg/lL cuando los pH del
Potasio mosto estan bajo los 3,3

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