Técnicas

blotting: Juan

Karen
Diego Cárdenas
Vanessa Delgado
Southern, Daniela López Londoño

Northern,
José Rodrigo Hernández
Juan Sebastián Torres

Western.
Técnicas blotting
 Blotting (Transferencia)

Northern Blot
Western Blot Southern
Blot

• Proteínas • RNA
• DNA

• Anticuerp
os • Sondas DNA • Sondas
marcados RNA
Electroforesis

● gel de poliacrilamida
● gel de agarosa
Transferencia

Autorradiografía
Técnicas de
hibridación
Técnicas de hibridación
 Construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios
 Relación genética entre dos ácidos nucleicos
 Localizar fragmentos específicos

Aspectos básicos

● Electroforesis
● Sondas
Electroforesis
Electroforesis
Sondas
Sondas

 Fragmentos de DNA o RNA de cadena

sencilla (100-1000 pb)

 Detecta presencia de DNA o RNA

complementario
Hibridación
Marcaje de sondas
 Enzimátic
 Radioactivo
o
Digoxigenina, Isótopos
biotina radiactivos
Sonda con
digoxigenina
Enzima polinucleótido cinasa
Introduce un único nucleótido
marcado en el extremo 5′ de la
sonda
POLINUCLEOTIDOCINASA
ATP + OLIGONUCLEOTIDO OLIGONUCLEOTIDO
MARCADO CON ATP
Enzima transferasa terminal deoxinucleotido
transferasa (TdT)
 Introduce varios
nucleótidos marcados en
el extremo 3′ de la sonda
Nick traslation

 Actividad DNasa 1

 Actividad de DNA polimerasa

Southern blot
 Fundamento
DNA digerido con enzimas de
restricción.

Presencia de un
gen o fragmentos
del DNA específicos

SE BASA EN:

Desnaturalización Hibridación
Procedimiento técnico
Tinción
Desnaturalización

Transferenci
a

R
ay
os
X Ma
rc
ac
n ió
Aplicaciones
Northern
blot
Diferencias

● RNA
● No hay uso de enzimas de
restricción
● Electroforesis en
condiciones
desnaturalizantes

BUSCA

evidencia la expresión de genes

 Aplicaciones

Estudio del Variaciones del

mRNA y su RNA en
regulación diferentes
condiciones

Comparación de
condiciones
Variación del clínicas normales y
tamaño en el patológicas
producto del
gen
Western
Blot
Aspectos generales
Proteínas específicas

George Stark
 Universidad de Stanford
  Difusión simple
 Transferencia al vacío
 Electrotransferenncia

Tinción:
Electroforesis Coomassie
Brilliant Blue

Análisis

Bloqueo
 Detección Anticuerpo unido a enzima

Método de dos
pasos

color quimioluminisc
encia
Marcaje de anticuerpos unidos a
fluorocromos

Método de un paso Radiactividad

Análisis

Detección
● Detección
marcadores
quimioluminiscente
radioactivos
(película fotográfica)
● Detección colorimétrica
Detección Densitometría
fluorescente
(fotosensor)
Aplicaciones