Aislamiento y recuento de

bacterias anaerobias
Alvarado Morales Kelly
De la cruz Villar Alan Eduardo
León Valverde Mario Santiago
Robles Aristeo J. Carlos
Objetivos
● Conocer algunas técnicas y medios de cultivo para aislamiento, recuento y
cultivo de bacterias anaerobias.
● Observar el efecto de los diferentes potenciales de oxidorreducción de los
medios de cultivo sobre el crecimiento de microorganismos aerobios,
anaerobios estrictos y anaerobios facultativos.
● Estimar la población de microorganismos anaerobios estrictos por el método
del Número Más Probable
Introducción
El oxígeno puede ser esencial para algunos microorganismos pero tóxico para
otros. La capacidad que tienen para crecer en presencia o ausencia de éste. está
directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de
enzimas que los protegen del efecto tóxico de los radicales libres que puede
generar el oxígeno, como la catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasa.
Relación de los microorganismos anaerobios con el
oxígeno

Con base a su tolerancia al oxígeno hay tres tipos de microorganismos

anaerobios:

● Anaerobios facultativos: crecen en presencia (respiración aeróbica) y

ausencia (fermentación) de oxígeno.
● Anaerobios estrictos: sólo crecen en ausencia de oxígeno (fermentación o
respiración anaeróbica).
● Anaerobios aerotolerantes: crecen en presencia de oxígeno sin que este
participe en su metabolismo.
Actividad enzimática sobre los radicales libres
Tipos de microorganismos con relación al
oxígeno
Grupo Relación con el O2 Tipo de metabolismo Ejemplo Hábitat

Aerobio
Estricto Necesario Respiración aerobia Micrococcus luteus Piel, polvo
Facultativos No es necesario, pero Respiración aerobia, Escherichia coli Intestino grueso de
crecen mejor con O2 respiración los mamíferos
anaerobia,
fermentación
Microaerófilcios Necesario, pero a Respiración aerobia Spirillum volutans lagos
concentración menor
que la atmosférica
Anaerobios
Aerotolerantes No necesario, no Fermentación Streptococcus Vias respiratorias
crecen mejor con O2 pyogenes altas
Estrictos Dañino o letal Fermentación o Methanobacterium Lodos residuales,
respiración anaerobia formicicum sedimentados
lacustres anóxicos
Tipos de microorganismos con relación al
oxígeno

Aerobio Anaerobio Anaerobio Anaerobios Microaerófilo

estricto facultativo estricto aerotolerantes
Técnicas para el cultivo de anaerobios
Algunas de las estrategias empleadas para eliminar el contenido de oxígeno y
reducir el potencial redox de los cultivos son:

● Adición de sustancias reductoras a los medios de cultivo líquidos como la

cisteína y el tioglicolato de sodio.
● Uso de tapones de rosca, sellos de aceite mineral o vaselina para evitar el
acceso del oxígeno a los cultivos.
● Calentamiento del medio de cultivo previo a su inoculación para eliminar el
oxígeno disuelto.
● Remoción del oxígeno de la atmósfera de incubación por medio de
reacciones químicas (sistema Gas Pak, Anaaerogen)
● Sustitución del oxígeno con otros gases (H2, N2 o CO2).
Número más probable
La determinación del contenido microbiano de una muestra por el método de
Número probable (NMP) , se basa en un método estadístico de estimación de
la población cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es
factible.
La técnica se basa en la determinación de presencia y ausencias en réplicas
de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos
presentes en muestras de suelos u otros ambientes.
El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de
este atributo en diluciones seriadas y una tabla probabilística.
Potencial Redox
El oxígeno también afecta el potencial de oxidorreducción de los medios de
cultivo, el cual está dado por la relación que existe entre los compuestos oxidados
y los compuestos reducidos presentes. La presencia de oxígeno disuelto en los
medios de cultivo da potenciales positivos; y potenciales negativos al añadir
sustancias reductoras al medio.
Jarra de anaerobiosis
Una jarra de anaerobiosis es un equipo utilizado en el laboratorio de microbiología
para promover el crecimiento de organismos anaerobios.

Consiste en un contenedor con tapa de cierre hermético, en el cual se introducen

las cajas petri, este sistema contiene un sobre con sustancias químicas que
reaccionan con el oxígeno del ambiente, consumiendolo en su totalidad,
promoviendo así una atmósfera anóxica.
Sistema Anaerogen
Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente
activo al ácido ascórbico.

La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y alcanzó una

temperatura de 65ºC.
 Medios de cultivo
empleados en la práctica
Agar sangre
Medio enriquecido por la presencia de una infusión de corazón y diferencial
debido a la sangre; crecimiento de microorganismos aún nutricionalmente
exigentes y puede presentar hemólisis de tipo alfa, beta o gamma.
 Medio: Leche-fierro
El sustrato que se utilizó, fue la proteína caseína y a la lactosa que es disacárido.
Este permite que en situaciones anaeróbicas (tapón de aceite) el microorganismo
realice la fermentación usando como aceptor final el fierro (Fe3+) (clavo)
reduciéndolo a (Fe2+), siendo que en situaciones ácidas se coagule la leche
(precipitando proteínas).

Lactosa
+ Glucosa + Galactosa Glucosa piruvato
caseína Beta-
galactosidas
a CO2 +H2
ácidos
Caldo carne
Este medio contiene extractos de corazón bovino, posee un sello de nujol que
sirve para evitar la entrada del oxígeno al medio. El medio reductor de este medio
son los aminoácidos de la carne que poseen azufre en su estructura como la
cisteína; la disponibilidad de los grupos sulfhidrilo aumenta en la proteína
desnaturalizada.
Caldo Tioglicolato
Es un medio reductor, el cual posee un indicador óxido-reducción, este indicador
es la Resazurina la cual es de color rojo cuando está reducida y es incolora en su
forma oxidada.

Contiene agar en pequeñas concentraciones (0.5%) que le da una apariencia

semi sólida, esto evita el movimiento de los microorganismos inoculados y evita el
paso del oxígeno.
Caldo nutritivo
Medio no selectivo compuesto de extracto de carne deshidratado y peptona;
ambos componentes constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarios
para microorganismos heterótrofos no exigentes.
 Método
Experimental
 Aislamiento de bacterias anaerobias en
una muestra de suelo o de materia fecal.
1g Dejar enfriar
A.C Asada de
y sedimentar
Dejar Calentar a ebullición sobrenadante
Muestra sedimentar durante 5 minutos
D.C
Asada de
sobrenadante

Incubar a 37°C
durante 48 hrs
Sembrar por estría cruzada
en agar tioglicolato
 Cultivo en jarra de anaerobiosis (Sistema Gas
Pak).
Agar
1 gota sangre

{
Incubar 1 placa de
cada medio en
condiciones aeróbicas
a 37°C durante 48 hrs

Clostridium sp
{ Agar
Las placas
restantes

tioglicolato
Teñir por gram
y observar Describir Incubar a 37°C
morfología morfología durante 48 hrs
microscópica colonial
Describir la morfología colonial de dos colonias
aisladas y de la cepa de referencia Clostridium sp
Morfología colonial de dos colonias aisladas
y de la cepa de referencia Clostridium sp

Colonia 1 Clostridium sp
Colonia 2
Describir la morfología microscópica de dos colonias
aisladas y de la cepa de referencia Clostridium sp
Característica Colonia 1 Colonia 2 Clostridium sp

Forma Bacilos Bacilo Bacilo

Agrupación Aislado Aislado Aislado

Tinción de Gram - - +

Presencia de - - +
endosporas
Morfología microscópica de dos colonias aisladas
y de la cepa de referencia Clostridium sp

Colonia 1 Colonia 2 Clostridium sp

 Estimación de clostridium sp en una
muestra de suelo o de materia fecal.
1 ml 1ml 1ml

-1 g de
muestra
-En 9 ml de
agua destilada

Tubos con fermentación

Incubar a 43°C durante 18 a
tormentosa son positivos y
24 hrs
estimar el NMP/g de muestra
original
Calcular el NMP/g de anaerobios en la
muestra. Lab 3
Calcular el NMP/g de anaerobios en la
muestra. Lab 4
Tubos con Fermentación tormentosa
Tubos con Fermentación tormentosa
 Comparación del crecimiento en medios líquidos
de diferente potencial de oxidorreducción.

Clostridium sp Inocular en el
fondo con
pipeta estéril Incubar a 37°C de
24 a 48 hrs

Escherichia coli

Observar el
Caldo Caldo Caldo crecimiento y su
nutritivo tioglicolato carne localización
Bacillus megaterium
 Crecimiento de las cepas
Bacillus megaterium

Medio de cultivo Caldo nutritivo Caldo tioglicolato Caldo carne

Zona de crecimiento Se ve en el fondo Justo en el indicador No crece

Tipo de crecimiento Crecimiento en membrana

Requerimiento de Aerobio estricto

Oxígeno
Bacillus megaterium
 Crecimiento de las cepas
Escherichia coli

Medio de cultivo Caldo nutritivo Caldo tioglicolato Caldo carne

Tipo de crecimiento Floculento

Requerimiento de Anaerobio facultativo

Oxígeno
Escherichia coli
 Crecimiento de las cepas
Clostridium sp

Medio de cultivo Caldo nutritivo Caldo tioglicolato Caldo carne

Zona de crecimiento Toda la zona por En el fondo

No crece debajo del indicador

Tipo de crecimiento En el fondo del tubo

Requerimiento de Anaerobio estricto

Oxígeno
Clostridium sp
Cuestionario
Cuestionario
 Conclusiones
● Presencia de más de 1100 NMP/g
● Todos los tubos de leche-fierro presentaron fermentación tormentosa
● Bacterias encontradas en la muestra de heces fecales de burro, caballo y vaca
tiene la enzima β-galactosidasa.
● Entre las bacterias aisladas de la muestra se encuentran bacterias anaerobias y
anaerobias facultativas.
● El género Clostridium es anaerobio estricto.
● Bacillus megatherium es un microorganismo aerobio estricto.
● Escherichia coli es un microorganismo anaerobio facultativo.