Secuenciación de

genomas

Valery Daniela Rodríguez Suárez

Introducción
Podemos definir la genómica como la subdisciplina de la genética interesada en la descripción y análisis molecular
de genomas completos.

Habitualmente la genómica se suele subdividir en dos grandes áreas:

Genómica estructural: se ocupa de la caracterización de la naturaleza física de los genomas.

Genómica funcional: cuyo objetivo último es ubicar todos los elementos integrantes de un genoma dentro de una
estructura funcional, tanto en el sentido más tradicional de determinar la función de cada una de los elementos
componentes de un genoma (las proteínas codificadas, los elementos reguladores, estructurales, etc) como en el
sentido más general de determinar el papel que cada uno de estos elementos desempeña en el funcionamiento
global del organismo.
Secuenciación de Sanger consiste en hacer muchas
copias de una región blanco de ADN. Sus ingredientes
son similares a los necesarios para la replicación del
ADN en un organismo o para la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), que copia el ADN in vitro. Los
ingredientes son:

• Una enzima ADN polimerasa

• Un cebador, que es un fragmento pequeño de ADN
monocatenario que se une al molde de ADN y
actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
• Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP).
• El molde de ADN que será secuenciado.

Fred Sanger (1977)

Introducción
 Bocavirus humano (HBoV) es un virus descrito por .primera vez en el año 2005 por Allander y cois, identificado en
muestras de aspirado nasofaríngeo (ANF) en niños con infecciones del tracto respiratorio inferior. El virus fue
descubierto por métodos moleculares, utilizando un sistema de amplificación no específica y clonación de la
secuencia genómica viral de un parvovirus humano previamente no descrito. El virus fue aislado en secreciones
respiratorias procedentes de lactantes y niños suecos con manifestaciones clínicas de enfermedad del tracto
respiratorio.

 Las secuencias genéticas y el análisis filogenético muestran una estrecha relación de HBoV con dos miembros de la
familia Parvoviridae: parvovirus bovino (BPV) y virus minute canino (CMnV), por lo que recibió el nombre
provisorio de bocavirus humano (HBoV), "bo" de bovino y "ca" de canino.

(Moreno, 2009)
El genoma de HBoV1 tiene aproximadamente 5.300 nucleótidos y está organizado en 3 marcos de lectura: NS1, con
funciones en la replicación viral, presente en todos los miembros de la familia Parvoviridae , NP1 propia de los
bocavirus solamente y factor regulador del ciclo viral y VP1/VP2, el cual codifica las proteínas estructurales que
constituyen la cápside viral y participan en la entrada del virus a la célula.
OBJETIVOS
• Amplificar y secuenciar el genoma
completo de HBoV respiratorio aislado
localmente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de HBoV1.

 Se colectó una muestra de secreción respiratoria, obtenida por aspirado nasofaríngeo de una
niña internada en el Hospital Pediátrico de Córdoba en 2009 con diagnóstico de bronquiolitis.
 Esta muestra se denominó HBoV1 307_AR09.
 Se preservó una alícuota de la muestra original y se almacenó a una temperatura de -70°C
desde el momento de su obtención.

Extracción de ácidos nucleicos.

 Alícuota de 50 μl de ANF para extracción de ácidos nucleicos con buffer de guanidina y
precipitación con sílica.
 El extracto fue resuspendido en buffer TE y almacenado a -20°C hasta completar los ensayos de
PCR posteriores
MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño de primers.

Selección de las regiones óptimas de los cebadores o primers

Alineamiento de múltiples secuencias completas de HBoV1 obtenidas de la base de datos pública GenBank ®
representativas de distintas regiones del mundo.
Números de acceso:

 NC_007455.1
 DQ000496.1
 AB480174.1
 DQ340570.1
 EF203920.1
 EF450740.1
 FJ858259.1
 GQ925675.1
 JF699044.1
 JF327789.1
 EU984244.1
 GQ926983.1
MATERIALES Y MÉTODOS
Amplificación del genoma completo de HBoV1 por PCR.

 Inicialmente se utilizaron protocolos de PCR estándares con reactivos de la firma Invitrogen (2,5 mM MgCl2; 0,8
mM mezcla equimolar de dATP, dTTP, dCTP y dGTP; 0,02 U/μL Taq DNA polimerasa; y 0,4 μM de cada primer,
forward y reverse) con un gradiente de temperaturas de recocido, incluyendo la temperatura teórica apropiada
para cada par de primers diseñados.

 Las concentraciones de MgCl2, dNTPs y primers fueron ajustadas durante el proceso de optimización.

 Una vez identificadas las mejores condiciones de amplificación se definieron los protocolos finales y luego se
realizaron los ensayos de PCR para posterior secuenciación utilizando en este caso la enzima Platinum Taq DNA
Polymerase High Fidelity (Invitrogen), en un volumen total de 50 μl por tubo de reacción con 5 μl de templado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Visualización de los productos de PCR.

 Los productos de reacción de los ensayos de optimización fueron visualizados mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida al 8,5% teñido con solución de nitrato de plata.

 Los productos de PCR para secuenciar se corroboraron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñido
con bromuro de etidio 0,5 μg/μl, con el objetivo de comprobar la presencia de producto en la concentración
mínima requerida para los ensayos de secuenciación.
 MATERIALES Y MÉTODOS
Secuenciación y análisis genético.

 Los productos de amplificación fueron purificados en columnas de extracción Qiagen PCR cleanup kit y la
secuenciación se realizó bidireccionalmente en cada fragmento amplificado, utilizando la tecnología de ABI PRISM
3100 Genetic Analyzer – BigDye Terminator v. 3.1.

 Las secuencias obtenidas fueron editadas, alineadas y ensambladas utilizando el programa Clustal. El genoma
completo de HBoV1 cepa AR09_307 se obtuvo mediante la superposición de todos los segmentos de NS1, NP1 y
VP1/VP2.

 El análisis filogenético se realizó con el programa MEGA v6 incluyendo secuencias de genomas completos
representativas de las cuatro especies de bocavirus humanos identificadas hasta el momento y disponibles en
GenBank (números de acceso EU918736.1, HQ113143.1, FJ170280.1, NC_012042.1, HM132056.1, GQ200737.1,
FJ973558.1, FJ973560.1, NC_012729.2, DQ000495.1, DQ000496.1, NC_007455.1, JQ923422.1).

 La reconstrucción filogenética se ejecutó siguiendo el método Neighbor Joining realizando la inferencia a partir de
matrices de distancia genética basadas en el modelo Kimura- 2 parámetros, con bootstrap para 1000
replicaciones.
Software
DISEÑO DE PRIMERS
• NCBI (National Center for Biotechnology Information)

 PrimerDesinging Tool: consisteen un modulo para el diseño de cebadores para la medición de PCR en tiempo real de la
expresión de genes eucarióticos
o Busca pares de cebadores de secuenciación PCR / Sanger correctos a partir de una base de datos de ~ 650,000
pares de cebadores prediseñados para resecuenciar el exoma humano y el genoma mitocondrial humano.
o Elije entre diferentes longitudes de amplicón para adaptarse a diversas aplicaciones de investigación y tipos de
muestras biológicas.

 Primer-Blast: consiste en un módulo para generar pares de cebadores candidatos y un módulo para verificar la
especificidad del objetivo de los pares de cebadores generados.

o Examina los objetivos potenciales

o Verifica la especificidad de los cebadores preexistentes
o Admite la posición de cebadores basados ​en las ubicaciones de exón / intrón y la exclusión de sitios de polimorfismo
de nucleótido único (SNP) asociadas con la plantilla de la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology
Information) en cebadores.

 OligoAnalyzer: Identifica las propiedades de los oligonucleótidos, incluida la temperatura de fusión, las horquillas, los
dímeros y los desajustes
Software
• SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS GENÉTICO

 ClustalW2: La Alineación de Secuencia Múltiple (MSA) es generalmente la alineación de tres o más secuencias
biológicas (proteína o ácido nucleico) de longitud similar. A partir del resultado, se puede inferir la homología y
las relaciones evolutivas entre las secuencias estudiadas.

• Se diseñaron pares de primers dirigidos para la amplificación de fragmentos consecutivos y superpuestos del
genoma completo de HBoV1 con parámetros de búsqueda estándar.
• La síntesis de los oligonucleótidos se solicitó a Invitrogen Argentina y los stocks de uso se prepararon con H2O
deionizada (grado PCR) a una concentración de 100 μM.
Protocolo básico para un análisis filogenético de secuencias moleculares

Colección de secuencias homologas

GENBANK

Alineamiento múltiple de secuencias

Sofware : NCBI Primer-Blast

Analisis evolutivo del alineamiento y selección del modelo de sustitución

mas ajustado

Estima filogenetica
Neighbor Joining

Pruebas de confiabilidad de la topología inferida

Bootstrap

Interpretación evolutiva y aplicación de las filogenias

Sofware: ClustalW (CCG,2011)
RESULTADOS
Diseño de primers: Pares de oligonucleótidos
RESULTADOS
Optimización de los protocolos de PCR y amplificación de genoma completo de HBoV1.

 Los protocolos de PCR fueron optimizados

mediante el ajuste de la temperatura de
anillamiento
 RESULTADOS
SECUENCIACIÓN Y ANÁLISIS GENÉTICO

 Los ensayos de secuenciación arrojaron resultados con parámetros de calidad optima, obteniéndose de esta la secuencia completa de HBoV1
cepa AR09_307 (GenBank KJ634207)
 El análisis filogenético incluye las secuencias de 11 genomas HBoV (1-4) exponiendo agrupamientos de la cepa AR09_307 con otros
aislamientos, sugiriendo alta homología entre AR09_307 con otras secuencias de HBoV1, en particular con DQ000495 (dis. 0,002) y una mayor
distancia con los genotipos HBoV2 y HBoV4.
 RESULTADOS

Fig. 1. Árbol filogenético representativo de las distancias genéticas entre los genomas completos de especies de bocavirus humano,
incluyendo la cepa HBoV1 307AR09.
El parvovirus humano 4 se utilizó como “raíz”; el método de inferencia fue Neighbor Joining con matrices de distancia genética basadas en
el modelo Kimura-2 parámetros y bootstrap para 1000 replicaciones. Se observa la mínima distancia genética entre HBoV1 307_AR09 y la
secuencia DQ000495 (Suecia, 2005) y el clustering HBoV1-HBoV3 y HBoV4-HBoV2.
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
 Hay homología entre la cepa local AR09_307 y la cepa Sueca DQ000495 identificada en 2005 por Allander.

 El análisis comparativo de secuencias entre los cuatro genotipos de HBoV reflejó mayor distancia entre la
cepa local AR09_307 y las cepas HBoV2 y HBoV4, mientras que con las cepas HBoV3 hubo una distancia
intermedia.

 En comparación con análisis realizados anteriormente por algunos autores, los resultados de los análisis
realizados con fragmentos del genoma, no son comparables, en particular si se hace referencia al marco de
lectura VP1/VP2. Sin embargo estos presentan concordancias entre si, lo que le da soporte a la hipótesis
propuesta por el comité de taxonomía de virus de cambiar el nombre del género Bocavirus a
Bocaparvovirus y reubicar los tipos de la siguiente manera:

 HBoV1-HBoV3 a bocaparvovirus primate 1

 HBoV2-HBoV4 a bocaparvovirus primate

CONCLUSIONES
MARCOS DE LECTURA

NS1 (253 a 2172)

 La cepa AR09_307 comparada con otras cepas de HBoV1, presento un total de 16 mutaciones de las
cuales 4 son constantes en mas de 2 secuencias

 La mayoría de las mutaciones ocurrió de igual manera en los dos grupos taxonómicos.
CONCLUSIONES
MARCOS DE LECTURA

NP1 (2410 a 3069)

 Se concluye que esta región es muy común en todas las especies de HBoV, encontrándose 12 mutaciones
diferentes para la misma ubicación en los cuatro genotipos y reflejando una mayor variabilidad
intergenotipica, basándose en el análisis de distancia genética se concuerda con la propuesta de Arthur y
colaboradores, en la teoría de la evolución de HBOV3.
 Basados en los resultados del alineamiento de los cuatro genotipos de HBoV se identifica un
entrecruzamiento e intercambio genético entre los genotipos HBOV1 y HBOV2, dando como hipótesis que
la coinfección con estos individuos da lugar a eventos de recombinación que generan una nueva especie
HBoV3 a partir de cepas ancestrales.
 Se presenta una alta homología entre el fragmento NP1 de cepas HBoV1-HBoV3, hallándose 7 mutaciones
puntuales.
CONCLUSIONES
MARCOS DE LECTURA

VP1/VP2 (3056 a5071)

 Este marco de lectura arroja una alta variabilidad tanto intraespecifica como interespecifica, siendo esta la
región con mayor numero de mutaciones para el genotipo HBoV1, sin embargo, solo el 17% permanecen
constantes en mas de dos secuencias.
 El valor de las mutaciones para esta zona, radica en la importancia de esta en la neutralización viral al
portar antígenos que son reconocidos por los receptores del sistema inmune.
 Esta zona presenta una mayor variabilidad genética intraespecifica.
CONCLUSIONES
MARCOS DE LECTURA

AR09_307 - DQ000495
 El análisis comparativo entre la cepa local AR09_307 y la secuencia descubierta por Allander-2005 da
evidencia de 22 mutaciones, de las cuales:

NS1-------------- 5 mutaciones
NP1-------------- 1 mutación
VP1/VP2-------- 16 mutaciones

Demostrando así la ala estabilidad genética de HBoV1, lo que podría encuadrarse en la función correctora de
errores de la polimerasa y en el escaso margen de su pequeño genoma
RECOMENDACIONES

 Se sugiere al Comité Internacional de Taxonomia de Virus cambiar el nombre del genero Bocavirus a
Bocaparvovirus y reubicar los tipos HBoV1 y HBoV3 en la especie Bocaparvovirus primate 1, en tanto que
los genotipos HBoV2 y HBoV4 correspoderían ahora a la especie Bocaparvovirus primate.

 Se invita a que este aporte tan significativo al estudio de la biología molecular de HBoV1 en nuestro medio,
sea utilizado tanto en investigación como en desarrollos tecnológicos de aplicación diagnóstica en la
práctica médica.

 Se recomienda profundizar los estudios referentes a la evolución molecular de los bocavirus.

 BIBLIOGRAFÍA

 CARDOZO TOMÁS, Agustina et al. Primer reporte de secuencia genómica completa y

análisis filogenético de Bocavirus Humano 1 aislado en Argentina. Revista de la Facultad de
Ciencias Médicas, [S.l.], v. 72, n. 3, p. 161-169, mar. 2016. ISSN 0014-6722. Disponible en:
https://revistas.unc.edu.ar/index.php/med/article/view/12114
 Moreno M, Claudia, Solís O, Yanahara, & O`Ryan G, Miguel. (2009). Bocavirus humano: Estudios en la
literatura médica y en Chile. Revista chilena de infectología, 26(6), 504-510. Disponible
en: https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000700003
 Centro de ciencias genómicas. (11 de septiembre de 2011). Obtenido de
http://www.ccg.unam.mx/~vinuesa/filoinfo_IE11/pdfs/Tema4_intro_filo_y_metodos_distancia.pdf