Aplicación de Proteínas

recombinantes en Biotecnología
Dra. Carola Bahamondes Donoso
c.bahamondesd@utem.cl
Descripción de la asignatura
• Asignatura electiva especializada
• Permite conocer el uso de las proteínas recombinantes en diversos
ámbitos de la biotecnología aplicada al sector salud y alimentos
• El alumno podrá integrar y analizar la aplicación y proyección de la
ingeniería genética a la biomedicina e industria de alimentos
Unidades temáticas de la asignatura
• I. Fundamentos de la Biología molecular aplicada al dearrollo de un
producto recombinante y sus aplicaciones
• II. Proteínas recombinantes y empresas biotecnológicas
• III. Conocer en terreno empresas o laboratorios de
desarrollo/producción de productos recombinantes
• IV evaluación
Evaluación de la asignatura
• Pruebas: evaluación global
• Controles escritos: 3 durante el semestre
• Seminarios: 2 durante el semestre
UNIDAD I

• FUNDAMENTOS Y CONCEPTOS DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES
Proteínas y su función
• La proteína es un componente importante de todos los organismos.
• Todas las funciones de las proteínas dependen de sus estructuras.
• De acuerdo con sus funciones en el cuerpo, las proteínas se pueden dividir en
diferentes categorías, como anticuerpos, enzimas, mensajeros, componentes
estructurales y proteínas de transporte / almacenamiento.
• Dadas las funciones importantes de las proteínas, las proteínas se han estudiado
intensivamente y se han aplicado ampliamente.
• En el pasado, la principal forma de obtener una proteína específica era aislarla de
una fuente natural, que generalmente es ineficiente y consume mucho tiempo.
• Los recientes avances en las técnicas biológicas de moléculas recombinantes han
hecho posible clonar el ADN que codifica una proteína específica en un vector de
expresión y expresar la proteína en sistemas de expresión, como bacterias,
levaduras, células de insectos y células de mamíferos.
Proteínas recombinantes
Definición
• Una manera importante de generar grandes cantidades de una
proteína específica es la tecnología de ADN recombinante, que
implica el uso de recombinación genética para reunir material
genético de múltiples fuentes, creando secuencias de ADN que,
naturalmente, no se encuentran en el genoma. Las proteínas
producidas con la tecnología del ADN recombinante son las llamadas
proteínas recombinantes
Aplicaciones de las proteínas Recombinantes:
• Las proteínas recombinantes tienen amplias aplicaciones en medicina,
investigación y biotecnología.
1. Medicina
• Las proteínas terapéuticas proporcionan terapias importantes para una
variedad de enfermedades, como diabetes, cáncer, enfermedades
infecciosas, hemofilia y anemia.
• Actualmente, la mayoría de todas las proteínas terapéuticas recombinantes
se producen en células de mamíferos porque las células de mamíferos son
capaces de producir proteínas de alta calidad similares a las naturales.
• Muchas proteínas terapéuticas recombinantes aprobadas se generan en
Escherichia coli
Proteínas terapéuticas
• Grupo I: proteínas terapéuticas con actividad enzimática o reguladora. Estas proteínas reemplazan a una
proteína deficiente o anormal, regulan al alza una vía existente o proporcionan una nueva función o
actividad.

• Grupo II: proteínas terapéuticas con especial actividad de direccionamiento. Estas proteínas interfieren con
una molécula u organismo o entregan otras moléculas.

• Grupo III: Proteínas terapéuticas como vacunas. Estas proteínas ayudan a proteger contra agentes extraños,
enfermedades autoinmunes y cáncer.

• Grupo IV: Proteínas terapéuticas como diagnóstico. Estas proteínas son generalmente proteínas purificadas y
recombinantes.
2. Investigación
• Las proteínas recombinantes ayudan a dilucidar los principios básicos y
fundamentales de un organismo.
• Las proteínas recombinantes se utilizan con frecuencia en biología molecular,
biología celular, bioquímica, estudios estructurales y biofísicos, y muchos otros
campos de investigación.
• Las proteínas recombinantes son herramientas útiles para comprender las
interacciones proteína-proteína. Han demostrado su rendimiento en varias
técnicas de laboratorio, como ELISA, Western Blot e inmunohistoquímica (IHC).
3. Biotecnología
• Las proteínas recombinantes también se utilizan en la industria, la producción de
alimentos, la agricultura y la bioingeniería.
• Sin embargo, las proteínas recombinantes también tienen limitaciones.
• En algunos casos, la producción de proteínas recombinantes es compleja, costosa y requiere
mucho tiempo.
• Las proteínas recombinantes producidas en las células pueden no ser las mismas que las
formas naturales. Esta diferencia puede reducir la efectividad de las proteínas recombinantes
terapéuticas e incluso causar efectos secundarios. Además, esta diferencia puede afectar los
resultados de los experimentos.
• Una preocupación importante para todos los fármacos recombinantes es la
inmunogenicidad. Todas las terapias producidas biotecnológicamente pueden exhibir alguna
forma de inmunogenicidad. Es difícil predecir la seguridad de nuevas proteínas terapéuticas.
Las últimas investigaciones de proteínas
recombinantes…
Proteínas recombinantes y enfermedad.
• El estudio dirigido por la Universidad de Georgetown, publicado en Scientific Reports, informó que la expresión forzada de la proteína FGFBP3 (BP3
para abreviar) en una cepa de laboratorio de ratones obesos mostró una notable reducción de su masa grasa a pesar de la predisposición genética a
comer a toda hora. Los resultados de este estudio sugieren que la proteína FGFBP3 podría ofrecer una terapia novedosa para revertir los trastornos
asociados con el síndrome metabólico, como la diabetes tipo 2 y la enfermedad del hígado graso. Pero, debido a que BP3 es una proteína natural y no
una droga artificial, los ensayos clínicos de BP3 humana recombinante podrían comenzar después de una ronda final de estudios preclínicos.
• El PD-L2, que juega un rol clave en la terapia de control inmunológico, es el foco del Premio Nobel de Fisiología y Medicina 2018. Este trabajo iniciado
por el profesor James P Allison de los EE. UU. Y el profesor Tasuku Honjo de Japón, ha dado lugar a tratamientos para los cánceres, como el
melanoma, el cáncer de pulmón y otros basados ​en la terapia de control inmunológico. Recientemente, AMSBIO ha agregado un importante producto
nuevo a su gama de inmunoterapia: un activador PD-L2 / TCR - Línea de células recombinantes CHO.
• En experimentos de prueba de concepto, investigadores de la Universidad de Alabama en Birmingham, dirigidos por X. Long Zheng, MD, Ph.D., Robert
B. Adams Profesor y Director de la División de Medicina de Laboratorio en el Departamento de Patología de la Escuela de la UAB de Medicina, han
resaltado una terapia potencial para un trastorno de coagulación sanguínea poco frecuente pero potencialmente mortal, el TTP. Los resultados de este
estudio por primera vez demuestran que la transfusión de plaquetas cargadas con rADAMTS13 puede ser un enfoque terapéutico novedoso y
potencialmente eficaz para la trombosis arterial, asociado con TTP congénita e inmunitaria.

Proteínas recombinantes y vacuna.

• Una nueva estrategia de vacunación, también conocida como el uso de una vacuna especializada contra el virus recombinante, podría ofrecer
protección a millones de pollos amenazados por una enfermedad respiratoria grave, informados por investigadores de la Universidad de Edimburgo y
el Instituto Pirbright. Estas vacunas utilizan versiones inofensivas o débiles de un virus o bacteria para introducir microbios en las células del cuerpo.
En este caso, los expertos usaron virus recombinantes con diferentes proteínas de punta como vacunas para construir dos versiones de un virus
inocuo.
• Según una nueva investigación publicada en Nature Communications, una nueva vacuna, también llamada LASSARAB, diseñada para proteger a las
personas tanto de la fiebre de Lassa como de la rabia se mostró promisoria en las pruebas preclínicas. El candidato de vacuna recombinante
inactivado utiliza un vector o portador del virus de la rabia debilitado. El equipo de investigación insertó material genético del virus de Lassa en el
vector del virus de la rabia, por lo que la vacuna expresa proteínas de la superficie tanto del virus de Lassa como del virus de la rabia. Estas proteínas
de la superficie provocan una respuesta inmune contra los virus de Lassa y de la rabia. La vacuna recombinante se desactivó luego para "matar" el
virus de la rabia vivo utilizado para fabricar el portador.
ADN recombinante: expresión de proteínas
dentro de un m.o.
• Para cualquier organismo, las proteínas son uno de los materiales más
importantes que forman el cuerpo y realizan funciones esenciales.
• Desde que se descubrió la estructura actual del ADN en 1953, los principios
genéticos se han estudiado ampliamente.
• Ahora, está bien establecido que las proteínas están hechas de ADN a
través de un proceso de dos pasos. Donde una secuencia de DNA da
instrucciones para hacer una proteína específica (expresión génica =
expresión de Proteínas)
ADN recombinante
• El ADN recombinante (ADNr) es una cadena de ADN que se forma por la
combinación de dos o más secuencias de ADN.
• La recombinación genética es un proceso natural y también puede ser
manipulado artificialmente para varios propósitos
• Usando tecnología de ADN recombinante, los científicos pueden crear
nuevas secuencias de ADN que no existirían naturalmente en
circunstancias normales y condiciones ambientales.
• El ADN recombinante resultante se coloca en una célula huésped, donde se
expresa en una nueva proteína, que es la llamada proteína recombinante.
• La tecnología del ADN recombinante desempeña un papel crítico en la
producción de proteínas recombinantes para usos farmacéuticos, médicos,
agrícolas y otros.
¿Cómo hacer ADN recombinante?
• Clonación de ADN, la clonación molecular o la clonación de genes.
• Transferencia de un ADN extraño a un elemento genético auto-replicante de un
organismo, que eventualmente lleva a la amplificación del ADN extraño.
• Actualmente, hay tres métodos principales para hacer ADN recombinante:
• Transformación: Un fragmento de ADN extraño se corta y se inserta en un vector,
generalmente un plásmido. A continuación, el vector resultante se coloca en una célula
huésped, como la bacteria E. coli, donde se expresa el fragmento de ADN extraño. El proceso
de la célula bacteriana que absorbe el ADN extraño se llama transformación.
• Transformación no bacteriana: La transformación no bacteriana no utiliza bacterias como
célula huésped. Un ejemplo es la microinyección de ADN, donde se inyecta un ADN extraño
directamente en el núcleo de la célula receptora y utilizan microproyectiles de alta velocidad
para ayudar a bombardear ADN extraño en la célula receptora.
• Introducción a los fagos: Se utiliza un fago para transferir ADN extraño a la célula huésped y,
finalmente, el ADN de fago que contiene ADN extraño se inserta en el genoma de la célula
huésped.
Tecnología de Proteína recombinante
• ¿Qué sistema se debe utilizar para expresar la proteína?
• ¿Qué vector de expresión debe usarse?
• ¿Debería expresarse la proteína en longitud total o parcialmente?
• ¿Debería etiquetarse la proteína?
• ¿Cómo purificar la proteína?

• Como cada proteína es diferente, no hay una respuesta que sea eternamente
correcta. Cómo elegir entre tantas estrategias de producción depende en gran
medida de la proteína que intenta expresar.
Pasos en la producción de proteína
recombinante:
• Obtención del cDNA y creación del clon de expresión.
• Clonación
• Expresando la proteína en un sistema adecuado.
• Expresión de prueba a pequeña escala
• Purificacion de proteinas
• Caracterización de proteínas
Estrategias de expresión de una proteína
recombinante:
• Expresión de proteínas recombinantes in vitro
• Expresión de proteínas recombinantes en E. coli
• Expresión de proteínas recombinantes en levaduras.
• Expresión de proteínas recombinantes en insecto-baculovirus
• Expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos
Expresión de proteínas recombinantes in vitro
• Sistema de traducción in vitro.
• Utiliza el ARNm o ADN diana como plantilla, agrega el sustrato
y la energía necesaria para la síntesis de proteínas al sistema
enzimático a partir del extracto celular y sintetiza la proteína
diana in vitro.
• El sistema de expresión de proteínas libres de células simula
las células in vivo y reproduce el proceso de transcripción y
traducción de proteínas intracelulares.
• Necesita la existencia de diversos materiales necesarios para
la síntesis de proteínas, incluidos la energía, los factores de
transcripción y los factores de traducción, etc.
• El sistema es particularmente adecuado para la expresión de
proteínas transmembrana y proteínas tóxicas. Su característica
incluye ciclo corto y alto rendimiento.
Expresión de proteínas recombinantes in vitro
Ventajas:
• De alto rendimiento, algunas proteínas pueden alcanzar hasta 5 mg / ml. Actualmente, la mayoría
de los datos de proteínas de membrana se obtienen del sistema de expresión libre de células de
E. coli
• Sin restricciones en la estructura celular, puede expresar proteínas exógenas que son tóxicas para
las células huésped.
• De alto rendimiento, permite la expresión de varias proteínas diferentes simultáneamente en la
placa de múltiples pocillos en una variedad de condiciones diferentes. Es adecuado para la
investigación proteómica de alto rendimiento.
• El sistema de reacción abierto hace que las condiciones de reacción sean fáciles de cambiar, lo
que es útil para regular la transcripción de genes, la síntesis de proteínas y la modificación
postraduccional.
• Permitir la adición de aminoácidos no naturales o aminoácidos marcados con isótopos para
sintetizar proteínas para uso especial
• Menos pasos, simple proceso experimental, baja dependencia del equipo.
• Precio bajo y corto tiempo de producción
Expresión de proteínas recombinantes en E. coli
• El sistema de expresión de E. coli es considerado como el sistema de
expresión más económico, clásico y más comúnmente usado debido a
su estructura simple, antecedentes genéticos claros, alto rendimiento
de proteína objetivo y su corto período de cultivo.
• El sistema se utiliza principalmente para la preparación de antígenos,
la preparación de ligandos y la expresión de citocinas y bacterias
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli, etc.).
Expresión de proteínas recombinantes en E. coli
• Ventajas:
• Fondo genético claro
• Rentable, fácil para la producción a gran escala.
• Plazo de ejecución corto
• Crecimiento rápido y alto rendimiento
• Más opciones para vectores y etiquetas, mayor tasa de éxito: tan alto como
99.1%
• Fácil de optimizar varias condiciones para lograr los mejores resultados.
Expresión de proteínas recombinantes en levaduras
• Es un sistema de expresión eucariótico altamente económico que realiza tanto la expresión de
secreción como la expresión intracelular.
• El gen exógeno expresado por el sistema de expresión de levadura tiene cierta capacidad de
procesamiento postraduccional, la proteína exógena expresada tiene cierto grado de plegamiento
y modificación de la glicosilación
• Es más estable que las proteínas expresadas procarióticas, particularmente adecuada para la
expresión de genes eucarióticos y la preparación de Proteínas funcionales.
• La expresión de la secreción de levadura puede segregar la proteína exógena expresada en la
matriz extracelular, de modo que es fácil obtener una proteína de alta pureza.
• El sistema de expresión de levadura tiene muchas ventajas que hacen que su investigación y
aplicación sean cada vez más amplias.
Expresión de proteínas recombinantes en levaduras
• Ventajas:
• Rentable, alto nivel de expresión: tan alto como 100 mg / L (cultivo en matraz
Shake)
• No hay producción propia de endotoxina.
• Los productos tienen modificaciones postraduccionales: glicosilación,
fosforilación, acilación, etc., es más probable que tenga actividad biológica
• Los productos pueden ser adecuadamente plegados y eficientes de secreción.
• Es más estable que las proteínas procarióticas y es particularmente adecuado
para la expresión y preparación de proteínas funcionales como las proteínas
de la tuberculosis, la defensina, la interleucina y las citoquinas.
Expresión de proteínas recombinantes en
insecto-baculovirus
• El sistema de vectores de expresión de baculovirus de insectos (BEVS) pertenece
al sistema de expresión eucariótico y es un sistema de expresión con alta
seguridad.
• Tiene un gran genoma, que permite la inserción de grandes genes exógenos, por
lo tanto, tiene la gran ventaja de expresar proteínas con gran peso molecular.
• Tiene la capacidad de lograr una modificación postraduccional completa y
expresar de manera eficiente los genes exógenos.
• El sistema consiste en un vector de transferencia, un vector de baculovirus y la
célula huésped.
• El BEVS se usa ampliamente en el desarrollo de vacunas contra virus (como el
desarrollo de la vacuna contra el virus de la influenza y la vacuna contra el VPH),
la preparación de proteínas de señalización celular y citoquinas, así como el
desarrollo de la quinasa, etc.
Expresión de proteínas recombinantes en
insecto-baculovirus
• Ventajas:
• Gran capacidad: capacidad de portar fragmentos genéticos grandes; ventaja
en la expresión de proteínas grandes
• Alta seguridad: el baculovirus tiene una estricta especificidad de especie.
• Alta eficiencia de expresión: la proteína se puede expresar de manera
eficiente en las células infectadas en etapa tardía
• La modificación postraduccional del producto expresado es similar a la de las
células de mamíferos, en particular la glicosilación; La proteína es más
probable que sea bioactiva.
• El baculovirus es más fácil de amplificar y puede producir proteínas
recombinantes a gran escala.