SEMINARIO HPLC

Definición USP de HPLC

“Es una técnica de separación basada en
una fase estacionaria sólida y una fase
móvil líquida. Las separaciones se
logran por procesos de partición,
adsorción o intercambio iónico, según
el tipo de fase estacionaria empleada”
• Es una de las técnicas cuantitativas más
utilizadas debido a su versatilidad y a la
posibilidad de analizar una gran cantidad
de moléculas de distinto tipo y tamaño.

• HPLC es la automatización de las técnicas

cromatográficas tradicionales bajo
condiciones que permiten obtener un gran
aumento de la eficiencia y resolución.
¿Qué significa la sigla HPLC?
 Inicialmente la sigla HPLC significó
Hight Pressure Liquid Cromatography.

Los cromatografistas en la década del 60 se dieron

cuenta de que la presión solo era una
herramienta que forzaba a la FM a atravesar la
columna sin constituir una variable del sistema y
por lo tanto debieron buscarle otro significado a
la sigla

Hight Performance Liquid Cromatography

GENERALIDADES DE LA
CROMATOGRAFÍA
Equilibrio de distribución de la muestra con ambas fases
 Parámetros cromatográficos
1) Coeficiente de partición (K)
Es el equilibrio del analito entre la FM y la FE

Si K es alto, mayor afinidad por la FE. Por lo tanto el

analito se retiene más tiempo en la columna y presenta
elevado Tr
 Parámetros cromatográficos
Parámetros cromatográficos
2) Tiempo (o volumen) de retención (Tr):
Es el tiempo que tarda un analito en atravesar todo
el sistema cromatográfico

En el tiempo muerto (frente de solvente) no hay interacción.

Corresponde al mínimo tiempo necesario para atravesar el sistema sin
interacción con la FE.
 Parámetros cromatográficos
3) Factor de capacidad
Relacionado con el cociente de partición del analito

K‘:0-∞
Si el analito no se retiene su tiempo de elución será = TM
y K' =0
Si el analito se retiene irreversiblemente su Tr será
infinito al igual que K'
 Parámetros cromatográficos
3) Factor de capacidad
¿Cómo puedo modificar el factor de capacidad
de un analito?
 Parámetros cromatográficos
3) Factor de capacidad
¿Cómo puedo modificar el factor de capacidad
de un analito?

Se ajusta modificando la fuerza de elución de

la FM
 Parámetros cromatográficos

4) Factor de selectividad (α)

Velocidad de migración diferencial entre dos

analitos consecutivos en el cromatograma

A diferencia de K‘ no depende de la fuerza de

elución de la FM sino de la afinidad diferencial de
los analitos por la FE. Si no hay separación entre
dos analitos contíguos α=1
 Parámetros cromatográficos
4) Factor de selectividad (α)
¿Cómo puedo modificar el factor de
selectividad?
 Parámetros cromatográficos
4) Factor de selectividad (α)
¿Cómo puedo modificar el factor de
selectividad?

Cambio de pH
Apareante o complejante
Cambio de uno de los componentes de la FM
Cambio de FE
 Parámetros cromatográficos
5) Eficiencia de una columna
La eficiencia de una columna y su “poder separativo”
se mide en platos teóricos
¿Qué es un plato teórico?
El concepto fue desarrollado en 1941 por los químicos Martin y
Synge
Es el espacio (teórico) que ocuparía UN UNICO EQUILIBRIO en el
sistema
La cromatografía es un proceso continuo pero podría dividirse en
cortes o rodajas imaginarias donde se consigue un equilibrio
transitorio antes de que el analito avance hacia el siguiente
 Eficiencia de una columna
La eficiencia de una columna (N) depende de su
longitud (L) y de la altura del plato teórico (H)

¿Cómo calculo la altura de cada plato teórico?

Calculando el ancho de pico del cromatograma
 Eficiencia de una columna

Cuanto menos ancho es el pico, menor es la altura

del plato teórico y mayor la eficiencia de la
columna
Eficiencia de una columna

¿Cómo es la selectividad
entre estos dos sistemas?

TIEMPO DE RETENCIÓN

¿Cómo es la eficiencia
entre estos dos sistemas?

ANCHO DE PICO
¿Para que sirve medir la eficiencia de
una columna?
 FENÓMENOS DE
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Ensanchamiento de banda intracolumna
La primer ecuación de altura equivalente de plato
teórico y ensanchamiento de banda, fue
formulada por Van Deemter en 1956 para
describir los fenómenos de ensanchamiento de
banda en GC.
Ecuación de Van Deemter
1) Difusión en remolino
 También conocida como difusión de eddy o proceso multipaso

Gráfico de
HEPT vs. Veloc. lineal FM

Depende de: naturaleza del relleno y su calidad

diámetro de la partícula: a ↑D ↑A
2) Difusión longitudinal
Si un analito se abandona en un líquido (FM), sus moléculas no
permanecerán estancas sino que difundirán en todas direcciones hasta
que su concentración sea uniforme en el seno del líquido

HEPT vs. Veloc lineal FM

Depende de: velocidad de flujo: a ↑V ↓Dif Long

menos relevante para cromatografía líquida
3) Transferencia de masa
A medida que el analito se desplaza por la columna, sus moléculas se
transfieren, por un proceso reversible, desde la FM a la FE y de nuevo
a la FM. Las moléculas más cercanas a la FE serán mas favorables a
la interacción mientras que las más alejadas demorarán más tiempo

HEPT vs. Veloc lineal FM

Depende de: velocidad de flujo: a ↑V ↑resistencia a la transferencia

tamaño de partícula: a ↑TMÑ ↑resistencia a la transferencia
Ecuación de
Ecuación de Van
Van Deemter
Deemter

Gráfico de Van Deemter para una

columna hipotética
 Ensanchamiento de banda extracolumna
En condiciones ideales, el ancho de banda sólo depende de los
procesos ya descriptos (intracolumna). Sin embargo, varios
componentes del equipo cromatográfico son responsables
de un ensanchamiento adicional, lo que lleva a la pérdida de
eficiencia

 Volumen de inyección

 Volumen de tubuladuras

 Constante de tiempo del detector (velocidad de respuesta)

A ↑ constante de tiempo, respuesta más lenta. A ↓
constante de tiempo, respuesta más rápida
 Resolución

Es el objetivo primario de la cromatografía

Se calcula para cada par de picos contiguos
Algunos ejemplos de
resolución
Como mejorar la resolución
TIPOS DE HPLC
INSTRUMENTAL DE HPLC
PARTES DEL HPLC:

Recipientes para la fase móvil

Tuberías de acero
Sistema de bombeo
Sistema de inyección
Columna cromatográfica
Detector
Sistema de registro de datos
 1) Sistema de bombeo
• Circular la FM por todo el equipo
• Materiales resistentes a la corrosión (acero,
zafiro, teflón, rubí)
• Trabajan con caudales entre 0.1 y 10 mL/min
• Soportan altas presiones (hasta 6.000 psi)
• Tipos de bombas: -neumáticas
-bombas a pistón y
bombas de desplazamiento continuo
(bombas jeringas, para microbore y HPLC
 Bombas reciprocantes
Son las más empleadas

Pueden estar construidas con un pistón, dos pistones, tres

pistones, bomba a diafragma.
Bombas reciprocantes a pistón
 2) Sistema de inyección
• Permite introducir la muestra en solución sin
interrumpir el caudal de solvente a través del
sistema
• En HPLC son válvulas que orientan el caudal hacia
la columna, pasando o no según su posición, a
través de un “loop” en el cual se introduce la
muestra a inyectar
 Sistema de inyección
El loop es intercambiable para variar el volumen de
inyección (entre 5 y 2.000 μL)
En la inyección automática, las válvulas se accionan
mediante un motor eléctrico o neumático.
3) Columnas
 3) Columnas
•pH: estabilidad en el rango de 2-8.
A pH alto se disuelve la silica y a pH bajo se rompen las cadenas alquílicas.

FM pH=11

•Estabilidad mecánica: evitar los cambios bruscos de presión que pueden llevar
a la formación de canales. Estables hasta 6000 psi.
•Guardado columna: Tiempo corto (24 hs) FM
Tiempo medio (fin de semana) Agua
Tiempo prolongado Sv aprótico (ACN)
o contenido de
agua (<50%)
 4) Detectores
Características que deben cumplimentar los detectores:
-Respuesta lineal
-Amplio rango de respuesta
-No destructivo de la muestra (cromatografía
preparativa)
-No contribuir al ensanchamiento de banda extracol
-Adecuada relación señal ruido
-Tener constante de respuesta corta
-Robusto a cambios de temperatura
-Sensibilidad apropiada
 4) Detectores
MÉTODO VENTAJA/DESVENTAJA

ÍNDICE DE REFRACCIÓN General (Universal)

Alto límite de detección
No puede emplearse en gradiente
Baja robustez frente a cambios de Temp

DETECTOR UV o UV-VIS Selectivo

Rango 190 a 350 nm (UV/VIS 190-700 nm)
Detecta en el orden de nanogramos
λ Fija, variable o arreglo de diodos

DETECTOR DE FLUORESCENCIA Selectivo

Alta sensibilidad y especificidad
Detecta en el orden de trazas

ELECTROQUÍMICO Selectivo
Muy sensible y selectivo
ESPECTROMETRÍA DE MASAS Muy sensible
Información espectral
 Detector de arreglo de diodos

La luz de ambas lámparas se mezclan por un espejo y atraviesan la celda de flujo del
detector (por donde circula el eluyente cromatográfico) . El haz que abandona la celda
de flujo es dispersado por medio de una red de difracción fija y se recogen
simultáneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante una matriz de
fotodiodos (arreglo de fotodiodos, cuenta con 512). Rango de trabajo: 190-800 nm
 ¿Para que sirve en relación a un
UV-VIS de λ variable?
• Puede identificar los analitos por su
espectro completo de absorción UV-
VISIBLE.
• Determinar la pureza del pico que eluye
(checkeando si consiste en un único
componente o con impurezas mezcladas)
 Salida 3D de un detector de
arreglo de diodos

Ejes: Señal en función del tiempo

Absorción en función de la longitud de onda
 Detector de arreglo de diodos
• Drogas analizadas por UV:
Benzodiazepinas
Pseudoefedrina
Corticoides
 Detector de Fluorescencia
Al alcanzar el detector, los analitos se excitan mediante una fuente de luz (λ EX).
Esta energía absorbida, permite que alcancen un estado energético superior,
luego se relajan emitiendo luz de mayor longitud de onda (λ EM)
(fotoluminiscencia).
Es un detector de elevada sensibilidad y especificidad
 Detector de Fluorescencia
La fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado
perpendicularmente respecto al haz de excitación (esta configuración es para
evitar interferencias con el haz de excitación)
La fuente de radiación es una lámpara de flash de xenón
 Detector de Fluorescencia
• Drogas analizadas por fluorescencia:
Quinidina
Amlodipina
Vitamina A
 Reservorio FM Detec Fluoresc

Controlador

EL HPLC DE LA Detec Arreglo Diodo

Columna
DIV ANALISIS
INSTRUMENTAL Recolector de
Autoinyector
Fracciones
Bomba A Bomba B

Mixer
ALGUNAS “NOVEDADES”…
 ¿Cómo reducir los tiempos de
análisis?
Cromatografía
Líquida
Ultra rápida

Ventajas UPLC:
• 10 veces más rápido que un sistema de HPLC convencional
• Flujo entre 100 nl/min y 10 ml/min
• Volúmenes de inyección de 2-5 µl con buena reproducibilidad
• Resistencia para trabajar a presiones superiores a las convencionales
(porque se usa menor tamaño de partícula- hasta 2.2 μm)
• Menor consumo de solventes orgánicos
• Mayor altura de pico (mejora la sensibilidad y mayor LOD LOC)
• Mejor resolución de muestras complejas
FM: Agua : Acetonitrilo (30 : 70)
Temperatura = 40º C
Detección UV: 245 nm
Analitos:
1. Acetofenona
2. Propiofenona
3. Butirofenona
4. Valenofenona
5. Hexafenona
6. Heptafenona
7. Octafenona
 Columnas monolíticas
Es una columna cuyo relleno es una varilla de material
continuo poroso.
Posee 2 tipos de poros :unos de mayor tamaño (microporos
> 50 nm) que facilitan el pasaje de la fase móvil a través del
relleno y mesoporos (2-50 nm)que le dan la eficiencia de
separación.
 ¿Qué ventaja tiene frente a las
columnas convencionales?
Permite mayor velocidad de flujo de la fase móvil sin un
aumento considerable de la presión del sistema

Menor tiempo de análisis Menor tiempo para

equilibrar el sistema

Monolitos de polímeros orgánicos de

poliestireno/divinilbenceno (PS/DVB)

Rango de pH de trabajo
(2-12)
 HPLC Capilar

El diámetro interno de las columnas utilizadas se encuentra entre

50-200 µm y la longitud entre 5-15 cm (mismo material)
Se alcanzan presión y N similar a lo obtenido con columnas convencionales
Los flujos utilizados se encuentran en el rango del nL al µL / min.
Utilizado acoplado a MS en proteómica (es fácil de acoplar al masa)
Hay columnas de HPLC capilares-monolíticas!!!!
 BIBLIOGRAFÍA
• USP 30 Edición- 2007.
• Quatrocchi O. Introducción a la HPLC-
Aplicación y práctica 1992.
• Catálogo de productos MERCK.
• Catálogo de productos AGILENT.