Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
KROMATOGRAFI
• chroma yang berarti warna dan graphein
artinya"untuk menulis.",
• Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan
campuran menjadi komponennya berdasarkan
perbedaan sifat fisik masing-masing komponen.
• Komponen utama kromatografi adalah fasa
stationer dan fasa mobil
• Fase stasioner mungkin padat, atau cairan yang
didukung pada gel padat
• fase gerak dapat berupa gas atau cairan
Komponen utama kromatografi
fasa mobil
fasa stationer
sampel
• Pemisahan dicapai karena:
1 Perbedaan kekuatan adsorpsi atau koefisien
partisi antara fasa mobil dan fasa diam
(stationer).
2 perbedaan faktor kelarutan komponen
tertentu dalam fase gerak
3 Perbedaan kekuatan afinitas komponen
dalam fase diam, beberapa komponen akan
bergerak lebih cepat dari yang lain, sehingga
memudahkan pemisahan komponen dalam
campuran itu.
DIAGRAM METODA KROMATOGRAFI
SAMPEL
KOLOM DATAR
P P Med P
F. Tetap (Stationary)
Dua Fasa
F. Gerak (Mobile) ~ F. Cair
Fasa Tetap
Zat Cair = Kr. Partisi.
“PARTITION CHROM”
Zat Cair
Fasa Gerak
Gas
Dari 4 macam bentuk fasa yang dapat
digunakan untuk an. Kromatografi
Sistem Kromatografi dibedakan :
1. ƒG Cair ― ƒT Padat
Kr. Lapis Tipis = TLC
Krom Serapan
Kr. Penukar Ion
2. ƒG Gas ― ƒT Padat
Krom gas Padat = GC
3. ƒG Cair ― ƒT Cair
Krom Partisi Krom Kertas
4. ƒG Gas ― ƒT Cair
Krom. Gas Cair = GLC
Krom. Kolom Kapiler
.
Semua pemisahan dg kromatografi tgt
pada kenyataan bahwa senyawa-senyawa
yang dipisahkan, terdistribusi sendiri
diantara fasa-fasa gerak dan tetap dalam
perbandingan yang sangat berbeda-beda
satu sama lain.
1.KROMATOGRAFI SERAPAN
(Krom Kolom)
ƒT = Zat padat berfungsi sebagai adsorben
ƒG = Zat cair
Elektrostastik (Ionik)
Daya tarik dua dipol
Antara dipol dan dipol induksi
Kekuatan Vander Waals
Pipet
Kertas Saring
Isian Kolom
Kertas Saring
Glass Wool
Penampung Eluat
*) Me P aliran ƒ gerak
*) Me(-)jarak tempuh zat yg dianalisis
*) dlm proses partisi,dg menggunakan
bahan isian atau penyangga
(Packing Material)
Bahan isian sebagai penyangga harus inert
thd senyawa-2 yang akan dipisahkan.
fT (stasr). Berupa cairan yang dilapiskan
pada permukaan bahan penyangga (Packing
Material).
Ikatan antara bahan penyangga dg ƒT , dapat
berupa ikatan fisik maupun kimiawi.
Dua tipe bahan isian yang ada dipasaran
Pellicular Beads dan Microporous Prarticle.
Efisiensi tinggi karena plat teoritis dapat
mencapai 10.000 dalam kolom sepanjang 25
cm.
Kromatografi partisi cair - cair ƒT dan ƒG
harus ≠ bercampur.
Pelarut lebih polar digunakan sebagai ƒStat
sistem dinamakan Krom Fase Normal.
Contoh :
Air sebagai ƒT yang melapisi silika gel
secara tipis. Air ter-ads. 50% dari berat
silika gel. kadang-2 dipakai sistem buffer.
Untuk menghasilkan tR yang diharapkan
jumlah fraksi terlarut dalam ƒG berkisar 0,05
– 0,5.
Bila ƒT dipakai senyawa non polar, dan ƒG
polar merupakan kebalikan fase normal.
“Reverse Phase Chromatography” untuk ini
penyangga padat yang non polar dapat
digunakan bubuk karet dengan lapis tipis
benzen sebagai ƒT dan air sebagai ƒG.
SUSUNAN PERALATAN
Pada HPLC dan GLC ≠ jauh berbeda.
Komponen utama :
Reservoir pelarut untuk fase gerak
Pompa untuk mengalirkan fase gerak
/ mobile dg kecepatan dan tekanan
tetap
Injector untuk memasukkan sampel
Ada 2 macam On Coloum
Injection / Langsung
Holding Loop Injection / ≠ langsung
Kolom
Detector : D. Ultraviolet
D. Fluoresens
D. Konduktivitas
D. Indeks Refraksi
D. FID. “Flame Ionitation
Detector”.
Recorder
HPLC
• 2- Gas Chromatography (GC) 2 - Kromatografi Gas (GC)
SAMPEL
A+B
B
A
Bahan
Pengisi B
Kolom A B
Detektor
t0 t1 t2 t3 t4
Signal
A B
t
t1
[ ]
A t2
B
B
A
Jarak Migrasi
Cirikhas Kromatogram
• Setiap senyawa meninggalkan kolom dalam
bentuk simetri, sebagai kurve gaus
• Setiap puncak keluar dlm waktu tertentu, yang
dapat dipakai sebagai identifikasi senyawa
k populasi CS CM
mol cuplikan akan
tinggal lebih lama di ƒSts =
ƒo
Migrasi
Saat Seimbang
BM AM
BS BM
Kecepatan migrasi
AM AS ditentukan mol dalam
fasa gerak
BS AS
CM .VM 1
R 2 R
CM VM C S VS 1 k.VS / VM
ƒkapasitas VS
k. k'
VM
1
R harus selalu ≤ 1
1 k'
1 R 1
R 4 1 k'
1 k'
1
μx μ.R R
1 k'
μ 1
μx μx μ. ......(9)
1 k' 1 K. Vs Vm
Hub : μ , tR dan panjang kolom L.(cm)
L L L
tM tR μx
μ μx tR
μ.tM L L 1
tR .
μx tR tM 1 k'
L cm
tR dtk tR
μx cm dtk
tR
k'
tM
Konsep teori plat dari persamaan
binomial
Retensi kadang-kadang diukur dengan
satuan Volume
VR Vol total ƒG yang diperlukan untuk
mengelusi puncak senyawa x.
VR = tR x kecepatan alir ƒG melalui kolom
F = ml/dtk
VR = tR.F
Vol Total ƒG dalam kolom VM = tM.F
1
ux u.R R
1 k'
u
ux
1 k'
1
u. ......(5) *
1 K. Vs Vm
Hubungan u dg tR dan panjang lintasan
L(cm)
tm = waktu yang diperlukan oleh fasa mobil
itu sendiri (tanpa sampel) untuk keluar dari
fasa diam
L panjg L
tm ..tR 1 k' tm 1 k'....(6) *
u kecpt u
t R t m tR '
k' ....(7) *
tm tm
t'R )B
α .....(16)
t'R )A t’R t terkoreksi
RESOLUSI KOLOM = Rs
tR 2tR
Rs ......(17
A B 1 1 WA WB
WA . WB .
Rs = 2 2
0,75 2tR B tR A
Rs ......(18) 1
0 WA WB
A B
Rs = 1,0
Detektor
Signal
0
tRB
tRA ∆Z= ∆tR
A B Rs = 1,5
tm WA1/2 WB1/2
0 WA/2 WB/2
0 WA WB
t
METODA LUAS PEAK ∆
Resolusi = perubahan nyata antara dua
spesies B, A dalam kolom
σ2
H .....(22)
L
dari pers. Gauss
L2
N 2 ....(23)
σ
σ σ σ.tR
(24)..... .....(25)
μ L L
tR
W 4.τ
L.W
σ
4.t
g
2
L.W 2 t
R
(27)..... H N 16 ....(28)
16.t 2 W
R
Catatan tR, W diukur dg satuan yang sama.
Cara lain untuk menghitung /
memperkirakan N dg membandingkan
terhadap W ½ = Lebar ½ H.
2
t
N 5,54 R 29
W½ W
H i/2
W
dasar ∆
Substan A dan B mempunyai waktu retensi tRA = 16,40 tRB
= 17,63 menit pada kolom 30 cm. Lebar dasar puncak
A = 1,11 dan B = 1,21 menit. Hitung :
b. N = ∑ rata-rata plate dalam kolom
c. H = tinggi plate orisinil
d. Panjang kolom untuk mencapai RS = 1,5
e. Berapa waktu yang dibutuhkan untuk mengelusi B dari
kolom (d)
f. Berapa tinggi plate dibutuhkan untuk RS = 1,5 pada
kolom orisinil 30 cm dan waktu orisinil
Hubungan Antara Rs dan Kolom
Maka Pers
2t R B t R A tRB tR A
(18) RS R S ....(30)
WA WB W
tR
2
tRB tRA N
Pers (28) N = 16 RS . .....(31)
W tRB 4
k'B k'A N
RS . .....(32)
1 k'B 4
k'B N α 1 k'B
α RS . . ......(33)
k'A 4 α 1 k'B
2
α 1 k'B
2
N 16.R S
2
.....(34)
α 1 k'B
kA kB k'A k'B k' α 1
k'
.α 1
N
RS ......(35)
4 1 k'
Eliminasi k’A dg
substitusi = k’B/k’A
2t R B t R A
Rs ......(18)
WA WB
Bila diasumsikan WA = WB = W
2t R B t R A t R B t R A
Rs
2W W
1 k'
2 2
2 α
N 16.R S k' .....(36)
α 1
L 1
μB μ μ.
tRB 1 k'
NH.1 k'B
N t R B
L
H μ
3
1 k'B
2
16R S .H α
2
(37)..... t R B .
μ α 1 k'B 2
1/1 1/4 1/16
Rs = 0,6
Rs = 0,8
Rs = 1,25
Rs = 1,0
k’
diubah
Plat N
Teori
Faktor
Selektivit
as
T
Kadar b
Cuplikan
Vol. Eluat
Dari gambar cuplikan kromatogram terlihat /
terbaca
a. Cuplikan sedikit, Tinggi puncak naik
dg bertambahnya cuplikan
tR ≠ dipengaruhi RS tetap
B C D
A
Bentuk A A Terjadi karena ketidak
Berekor Kimia cocokan antara cuplikan
dengan ƒG atau ƒT.
Ditandai dengan lambat
kembali ekor puncak
pada garis dasar
Pemisahan terhadap
puncak berikutnya jadi
jelek
CS
Koef distribusi k tetap berlaku
CM
Hubungan koefisien distribusi dengan Rƒ
CM .A M
Rf
CM . A M C S . A S
AM AM
Rf
C .A
AM S S AM k . A S
CM
Luas penampang melintang sukar diukur
persamaan di atas kurang praktis,
Rƒ terbentuk dari:
*macam adsorben, *ketebalan,
*metoda arah pengembangan,
*kadar dan jumlah cuplikan, serta
*jarak yang ditempuh / noda.
Dengan melihat ketergantungan harga Rƒ
akan lebih mudah dan tepat
menggunakan harga Rƒ relataif atau R
standard.
Dimana suatu senyawa standard di (+) ke
cuplikan.
2
W
1
WA WB
Batas awal
Ditektor
Gambar rekaman kromatografi
A B dengan densitometri scan
Sinyal
Jarak migrasi
FAKTOR KAPASITAS
Persamaan-2 yang telah dijabarkan dapat
diadaptasi pada TLC.
tR, tM waktu yang dibutuhkan senyawa
bergerak dalam fasa ―~ dR
Bila μ kecepatan linier
dR dM
tM tR
dM dR
k'
dR
d
1 R
dM 1 Rf
k'
dR Rf
dM
Re solusi R S
2Z 2dR A dR B
RS
WA WB WA WB
N 1 k '
RS ....Pers(35)
4 1 k '
k 'B dM dR B dR A
k ' A dM dR A dR B
faktor selektivitas
Semua prosedur kromatografi, kondisi
optimum untuk suatu pemisahan merupakan
kecocokan antara f tetap dan f gerak.
Lempeng
KLT
Berupa
garis
3 – 6 mm
1,5 – 2 cm
PENOTOLAN CUPLIKAN
Lempeng lapis tipis konvensional (20 x 20,
20 x 10, 20 x 5) ,dengan tebal 0,2 mm.
. Cuplikan ditotolkan sebagai bercak bulat
dg diameter 3 – 6 mm, atau berupa garis
1,5 – 2 cm dari tepi bawah.
Tepi bawah
Lempeng
KLT
Berupa
3 – 6 mm
garis
1,5 – 2 cm
• Penotolan dengan mikro pipet atau
microsyringe diperlukan 1 – 20 μL.
Kelebihan bahan totolan
menyebabkan bercak asimetri
danperubahan harga Rƒ.
• Pengembangan Berkelanjutan
ƒ gerak dialirkan pada bagian atas
lempeng pengembang. Teknik ini
digunakan untuk senyawa dengan Rƒ
0,05 – 0,2 setelah pengembangan
pertama.
Pengembangan Dua Dimensi
Cuplikan ditotolkan di salah satu
pojok kemudian dikembangkan
seperti biasa.
Cuplikan
A B
Permukaan
Pelarut
C D
Pelarut 2
Faktor yg mempengaruhi gerakan noda dlm KLT yang
juga berpengaruh terhadap Rƒ
1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan.
2. Sifat adsorben dan derajat aktivitasnya.
Aktivitas di kan dg pemanasan dlm oven.
3. Tebal dan kerataan lapisan penyerap.
d pelarut
B
dC
A dB
dA
Awal
Bila permukaan pelarut mulai bergerak
sampai waktu tetentu/ditetapkan, kertas
Diambil dan dikeringkan.
R S 2.
17,63 16,40 1,06
1,11 1,21
2
tR
b. Persamaan N 16
W
2
16,40
NA 16 3,493
1,11
2
17,63
NB 16 3,397
1,21
3,493 3,397
NAB 3,445
2
c. HETP H L N
30
H 8,7 cm
3,445
d. k’ dan ≠ berubah dengan kenaikan N
ataupun L substitusikan N1 dan N2
pada persamaan :
N k'
RS 1
4 1 k '
R S1 N1 3,493
1,06
R S2 N2 3,397
R s 1,06 N 3,445 R S harapan 1,5
2
1,06 3,445 1,5
N2 3,445 6,9
1,5 N 1,06
L NH 6,9 8,7 60 cm
Elusi B dalam kolom () dengan RS =
1,5 membutuhkan waktu 35 menit.
e. Dengan persamaan
tR1 R S 12
tR 2 R S 22
16.R 2S .H 1 k '3
2
tR
1 k '
2
17,63 1,06 2
tR 2 1,5 2
tR 2 35 menit
f. Dari persamaan (e) H1 dan H2
disubstitusikan
tR1 R S12 H1
. tR1 tR 2
tR 2 R S 2 H2
2
ƒG Cair
Kromatografi
Partisi
ƒS Cair