UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA MTABÓLICA
DOCENTE: Jacira M. A. de Souza

DNA damage induced p53 downregulates Cdc20

by direct binding to its promoter causing chromatin remodeling
Taraswi Banerjee, Somsubhra Nath and Susanta Roychoudhury*
Molecular and Human Genetics Division, Indian Institute of Chemical Biology, Council of
Scientific and Industrial Research, Kolkata 700032, India

Discentes: Camila Morais

Diego Gomes
Fernanda Magalhães
José Paula Rodrigues
Paulo de Tasso
 O que é a p53 e qual a sua função
 Proteína supressora de tumor;
 Regula o ciclo celular,
funcionando como um supressor
tumoral que está envolvido na
prevenção do câncer, apoptose e
senescência;
 Expressões: “gene anjo da
guarda”, “guardiã do genoma” e
“guarda mestre” são utilizadas
para referir-se ao seu papel na
conservação da estabilidade,
evitando mutações no genoma.
O que é o Cdc20 e qual é a sua função

Molécula crítica no Checkpoint do fuso

mitótico;
Ativa o Complexo Promotor da Anáfase;
Ajuda a célula divisora a realizar anáfase;
Expressa em grande quantidade em células
tumorais, resultando em instabilidade
cromossômica.
 Proposta do Artigo
 Através de experimentos foi mostrado que a p53
induzida por dano de DNA promove regulação
negativa do Cdc20 ligando-se diretamente à sua
região promotora.
Como
 Examinar os efeitos da p53 no mRNA do Cdc20 e
atividade protéica;
 Verificar a regulação do Cdc20 a nível de
transcrição.
Ciclo Celular
Fases da Mitose
 O que são e a sua função

 SAC:
• Checkpoint do fuso mitótico (SAC);
• É um sistema de vigilância;
• Mantém a estabilidade genômica.
 Mad2 e BubR1:
• Componentes chaves do Checkpoint do Complexo
Mitótico (MCC);
• Ligam-se ao CDC20 e inibem a sua atividade.
 O MCC desliga-se do CDC20 e esse pode ativar o
Complexo Promotor da Anáfase (APC).
 Como ocorre a ativação
 Enzimas :
• Ubiquitina Ligase – Degrada a Securina;
• Protease Nuclear Separase – “Abre” ou “rompe” a Coesina
(metáfase); separação das cromátides-irmãs (anáfase).
 Ativação da p53
 Se dá por uma variedade de estresses genotóxicos:
Dano no DNA, estresse oxidativo e choques de calor;
 Tem relação com vários pontos do Ciclo Celular: G1/S e
G2/M.
* Fase M

p53 em Fibroblastos e Leveduras

 Atua na mitose;
Fibroblastos do tipo Selvagem (fuso mitótico rompido):
• Células detiveram a divisão celular;
• Células deficientes não detiveram a divisão celular;
 Leveduras: resultado similar ao dos fibroblastos.
 Dados recentes da p53

 Importante papel na transcrição do gene

SAC Mad1 L1;
 Liga-se ao Mad1 L1 e reprime a sua
transcrição;
 Não foi encontrado sítio consenso da p53;
 Genes alvo da repressão: DNA,
topoisomerase II, ciclina B, etc.
Ativação transcricional da p53

 Ligação a sítio consensu: 2 cópias 5’ RRRC

(A/T) (T/A) GYYY3’ separadas por 0-13 pb;
 Mecanismo de repressão da p53
desconhecido;
 A p53 pode reprimir ou interferir com fatores
transcricionais que geralmente transativam o
genes.
 Superespressões do CDC20

 Aneuploidia e outras anormalidades cromossômicas;

 CDC20 se mostrou superespressada em vários
carcinomas;
 SAC reduz o nível de CDC20, garantindo a completa
inibição do APC;
 Dano no DNA; Aumento da p53; repressão do Cdc20
em células de câncer humano;
 Essa repressão é trazida pela ligação direta da p53 no
promotor do Cdc2o resultando no remodelamento da
cromatina.
Pergunta, Hipóteses e predições
 Os níveis de p53 regulam negativamente a
ação da Cdc20?
 A p53 não atua na regulação negativa da ação do Cdc20.
• P1: os proteossomos degradam o cdc20.
 A p53 atua regulando a transcrição do Cdc20
• p1: a p53 atua ligando-se diretamente a região
promotora do gene Cdc20.
• p2:
 Materiais e Métodos
• Plasmídios;
 promotor de Cdc20 foi amplificado a partir do DNA genômico humano com os primers
5’TCTGAGCA... (para a frente) e 5’AACACG... (reverso);
 Fragmento clonado dentro da pTZ57R/T (Vetor) utilizando o método de clonagem T/A

Ligate to d(T) cloning

PCR vector

 Mutações direcionadas aos locais de ligação da p53 no promotor da cdc20 foram

criadas utilizando um kit de ferramentas de Mutagênese da Sratagene.
 Plasmídeo de expressão da p53 de tipo natural: pCMVp53 e hTERT.Luc
 Checagem dos clones feita usando o kit ABI big-dye Terminaot Kit e 3130x1 Genetic
Analyser
 Materiais e Métodos
 Linhas de celulas, transfecção e tratamento com
medicamentos

 Linhagens de células humanas HCT116 e MCF7 foram pegas da American Type Culture
Collection
 HepG2, foram dadas de presente (Dr. S. Adhya).
 Todas as células foram crescidas no DMEM suplementado com soro fetal de novilho a
10% (v/v).
 Com o uso de Lipofectamine 2000 foi possível a Transfecção.
 Indução da p53 feita a partir do tratamento das células com 5-fluorouracil
(1picograma/ml e 10 picograma/ml) e Etoposide (25 µM e 50 µM).
 Para liberar a repressão de genes mediada por histonas, houve o tratamento das
células com Trichostatin A.
 Materiais e Métodos
 RT-PCR

 Para isolamentodas linhagens de células, houve a utilização de TRIZOL;

 Cinco microgramas do total de RNA foi tratado com DNAse;
 Preparação de DNAc através da utilização de hexamer e MMLV-RT
 Materiais e Métodos
 Western Blot

 Anticorpos utilizados: anti-p53 (diluição de 1:1000), anti-CDC20 (diluição de 1:200),

anti-p21 (diluição de 1:200), anti-β actina (diluição de 1:2000)
 Materiais e Métodos
 Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

 Usado o kit ChIP da quick ingenex corporation.

 PCR da cromatina precipitada foi realizada com a ultilização dos primers indicado na
tabela 1.
 Materiais e Métodos
 Ensaio da Luciferase

 Após a transfecção as céluas foram lavadas com uma solução salina batizada com
fosfato.
 As culturas de células lisadas pelo kit de ensaio da luciferase, foram levadas à
centrífuga, no frio, a 12000rpm por 2 min.
 Sobrenatantes foram coletados em tubo fresco e foi adicionado substrado de ensaio de
luciferase.
 A luminescência foi medida com unidades de luz relativa(RLU), duas vezes para cada
lisado, levando a uma leitura com a luciferase sozinha e depois com o lisado dentro.
 A concentração total de proteínas em cada lisado foi determinada com um kit de
ensaio protéico e subseqüente usado para normalizar a atividade da luciferase.
 Cada ensaio foi feito duplicadamente e repetido três vezes, os valores foram
representados como significados de três experimentos.
 Materiais e Métodos
 Ensaio de mudança na mobilidade eletroforética

 Os oligonucleotídios de fita dupla foram preparados pela anelamento dos

oligonucleotídios de 5’-3’ e 3’-5’, com a administração de ATP e T4 polinucleotídios
Quinase.
 No ensaio de competição, um excesso molar de “100-fold” de DNA ,não marcado, foi
adicionado antes da incubação.
 Após a incubação, cada amostra foi eletroforisada em gel de poliacrilamina;
 Depois de secos, e expostos a autoradiografia (a 20ºC), e para o ensaio “supershift 5 µg
foram ministrados anticorpos anti-p53.
Regulação negativa de CDC20
por p53 natural

 Regulação Negativa de Cdc20 expressão

ectópica do p53.
 Onde ocorre a supressão?
Regulação negativa de CDC20
por p53 natural
 Efeito da p53 sobre a CDC20:
 mRNA;
 Expressão protéica;
 Uso de duas linhagens de células:
 HCT116;
 HepG2;
 5 Fluoro Uracil;
 Etoposide
 Resultados Preliminares

Células transfectadas com 0, 1, 2, 3, e 4 µg de plasmídeos pCMV p53 .

Células Tratadas com drogas
de dano ao DNA
 Células tratadas com
inibidores proteossomais
 • P53 regula CDC20 a nível transcricional:
Uso do pGL3;

Figura 2. (A) Sequência de DNA da região promotora da CDC20. (B) A medida

que a expressão de p53 aumenta, diminui aexpressão de luciferase dirigida pela
CDC20.
Figura 2.(C) Com o aumento da dose de 5FU, a atividade da
luciferase diminuiu (D) assim como com o aumento de etoposide.
 Modelo de Clonagem da região
promotora de Cdc20 no vetor de pGL3

NFY CDE CHR NFY +1

p53 Luciferase

AGGGCAGTCT AAGCTTATCTTCCAGAT AGGCAGGTTT

(-890 A -726bp)
 Ligação da p53 com a sequência de
oligonucleotídios do sítio de ligação
ChIP em células MCF7
tratadas 5FU
 CDC20 regulado negativamente por
ligação direta do p53 tipo-selvagem
à sua região promotora
Histona Deacetilase - HDA
 hTERT
Telomerase Transcripatase Reversa
Humana
Tratamento com Trichostatin A
Western Blot em células HCT 116
p53 induzida por dano ao DNA regula negativamente Cdc20 pela ligação
direta a sua região promotora causando o remodelamento da cromatina

DISCUSSÃO
 p53 é um gene ativado sob estresse celular ou
dano ao DNA
 Consenso para que uma sequência ou gene seja
considerado um elemento de resposta à p53:
 1º: p53 RE perto ou dentro do gene
 2º: o gene é regulado a nível de RNA ou proteína pela
p53 selvagem
 3º: mostrar que a indução por p53 pode regular um
gene de teste da mesma maneira que o gene de
interesse
 4º: Se estabelecer por ChIP que a p53 interage com o
RE e se liga a cromatina
 O local de ligação da p53 com o promotor da
Cdc20 tem dois “half-sites” que seguem a regra
5’-RRRCWWGYY-3’
 Orientação cabeça com cabeça:
5’
5’ 3’

 p53 RE do promotor da Cdc20: Poucos desvios e

região CWWG é altamente conservada.
 Em outros genes que respondem à p53:
 p53 RE é altamente degenerado
 Desvios na região consenso
 Tamanho da região entre os “half sites”:
 Maior em locais em que a p53 é repressor
 Menor em locais em que a p53 é ativador
 Mecanismos diretos de repressão de genes pela
p53:
 Sobreposição no local de ligação
 Inibição de ativadores da transcrição
 Recrutamento de histonas deacetilases
 Mecanismos indiretos de repressão de genes
pela p53:
 Ativação da CDKN1A: inibe complexo ciclinaD-CDK4
-> não fosforila o fator de transcrição NFY
 Ligação da p53 a outro fator de transcrição e
repressão do gene alvo sem RE p53-específico
 Outros mecanismos de repressão indiretos
descobertos neste estudo:
 p53 reprime o promotor da Cdc20 via elemento
CDE/CHR (independente de p21)
 Regulação de checkpoints do ciclo celular G1/S e
G2/M: bastante conhecidos
 Regulação do SAC: pouco estudada
 p53 usa múltiplos genes como alvos para
controlar a função do SAC
 Anormalidades mitóticas devido à expressão
exagerada ou inibida do SAC são encontradas
em células tumorais
 Expressão exagerada de CDC20 inicia uma
anáfase prematura
 Conclusão
 Com os resultados apresentados, realmente é
comprovado que o trabalho é de grande
relevância, pois ele tem um papel forte no
estudo da prevenção de células tumorais. Tendo
a atuação da p53 como supressor do gene de
ativação do anáfase, Cdc20, impedindo a divisão
celular.
* Apesar de ser uma publicação recente os
experimentos realizados mostraram resultados
essenciais para futuras pesquisas oncológicas.
Ensaios ChIP em diferentes
linhagens