UNIVERSIDAD ESTATAL DE BOLIVAR

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

BIOTECNOLOGIA

Profesor:

Carlos Jácome Pilco, Ph.D.

Ciclo lectivo: octubre 2017 / marzo 2018

 UNIDADES Y CONTENIDOS
UNIDAD 1: BIENES Y SERVICIOS GENERADOS POR LA BIOTECNOLOGÍA

1.1 Historia evolutiva de la biotecnología;

1.2 Definición de biotecnología, ciencias que sustentan la
Biotecnología;
1.3 Avances y tendencias:
1.4 Generalidades sobre indústrias de procesos biotecnológicos;

UNIDAD 2: BASES BIOLÓGICAS DE LA BIOTECNOLOGÍA

2.1 Estructura celular de procariotas y eucariotas;

2.2 Organización del material genético;
2.3 Bases bioquímicas de la herencia;
2.4 El Dogma de la Biología Molecular;
UNIDAD 3: TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

3.1 Clonación;
3.2 Vectores de Clonación;
3.3 Técnicas de Biología Molecular;
3.4 PCR;

UNIDAD 4: PRINCIPIOS DE FERMENTACIÓN

4.1 Definición y concepto de fermentación;

4.2 Clasificación de las fermentaciones;
4.3 Requerimientos nutricionales;
4.4 Fermentaciones Agroindustriales;
 UNIDAD I

BIENES Y SERVICIOS GENERADOS POR LA

BIOTECNOLOGÍA
Una reflexión previa…

“Si no cambiamos nuestros patrones

de pensamiento, no vamos a poder
resolver los problemas que hemos
creado con nuestros actuales
patrones de pensamiento.”

Albert Einstein

5
1. HISTORIA EVOLUTIVA DE
LABIOTECNOLOGIA
Hacer pan o fabricar cerveza es Biotecnología

7
Primera Generación
Desde 6000-4000 años A.C. hasta finales del siglo XIX.

El pan y la cerveza constituían

una forma de alimentación
básica para los antiguos
egipcios
 La Biotecnología de Primera Generación,
está representada por productos de gran
demanda como: Pan, Cerveza, Vino,
Vinagre, Quesos, Yogurt
 Obtenidos por “fermentación espontánea”
 En esta etapa el hombre no tiene
conciencia de por qué ocurren estos
“procesos” .
 EVOLUCIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA
Primera etapa de desarrollo

Pan Vino
Yogurt

Queso Vinagre
Primera Etapa
Procesos espontáneos

Finales
Inicio de la
Siglo XIX
civilización
Tiempo
Segunda Generación
Inicios del siglo XX hasta la segunda mitad del siglo.
 Biotecnología de Segunda Generación o “Era de
los Antibióticos”.
 Desarrollo más acelerado del conocimiento
científico técnico.

Productos: Antibióticos, Vacunas naturales,

Vitaminas, Proteínas unicelulares, Enzimas,
polisacáridos, Alcohol industrial, Acetona,
Butanol y otros productos de gran utilidad para el
hombre.
Esta etapa se caracteriza por:

 Desarrollo científico-técnico de la
ingeniería de procesos
 Transformaciones microbianas
 Inmovilización de células
 Cultivos de tejidos
 Fermentaciones continuas
 EVOLUCIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA
Segunda etapa de desarrollo

Antibióticos
Vitaminas

Proteínas

Enzimas

Primera

Inicio de la Finales Primera mitad Finales Principio

civilización Siglo XIX Siglo XX Siglo XX Siglo XXI
Tiempo
Tercera Generación

Segunda mitad del siglo XX hasta finales del siglo.

 Surge con el desarrollo de la Biología Molecular y la

Ingeniería Genética.

 Ya es posible traspasar las barreras entre especies

e introducir genes de un organismo en otro no
relacionado.

 Ocurre una explosión en el desarrollo científico técnico

de las ciencias afines a la Biotecnología.

 Productos: Insulina Humana, Anticuerpos

Monoclonales, Vacunas y Fármacos Recombinantes,
Transgénesis (Plantas y Animales recombinantes).
Expresión de Insulina en Bacterias
Esta etapa se caracteriza por:

 Desarrollo de la Ingeniería Genética y la

Técnica de los Hibridomas.
 Descubrimientos más relevantes

1. Estructura y funciones de las proteínas (Moléculas

de la vida).

1953- F. SANGER: Logra

por primera vez
establecer la estructura
de la proteína Insulina

Frederick Sanger
Premio Nobel de
Química 1958
2. Definición que el ADN forma una doble
cadena, donde la unidad estructural son los
nucleótidos.

1953- J. WATSON y F. CRICK:

Demuestran la estructura en doble
hélice de la cadena del ácido
desoxirribonucleico (ADN),
portador de la información genética
(transmisoras de la herencia).
J. Watson y F. Crick
Premio Nobel de Medicina
1962
3. Elementos del Código Genético y su Universalidad.

1963- NIREMBERG: Descubre el Código

Genético contenido en las moléculas de
ADN, y el descifrado y Universalidad del
mismo.

4. Producción de anticuerpos.

5. Recombinación genética.

1960-1970- Se producen grandes progresos

en los estudios de la estructura de proteínas
y de ácidos nucleicos.

Marshall Nirenberg
 EVOLUCIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA
Tercera etapa de desarrollo

Organismos
Ingeniería
genética
Productos transgénicos

Tercera
Segunda
Primera

Inicio de la Finales Primera mitad Finales

civilización Siglo XIX Siglo XX Siglo XX
Tiempo
Cuarta Generación
Finales del siglo XX en adelante:

 Búsqueda de nuevos productos, donde la satisfacción de

las necesidades del hombre sigue siendo el principal
objetivo tanto en la alimentación, salud y bienestar social.

 Auge extraordinario de las ciencias que soportan a la

Biotecnología.

 Son un hecho en sí la Genómica y la Proteómica.

 Surge la Bioinformática.

 Productos: Terapia génica y Medicina personalizada.

Esta etapa se caracteriza:

 Desarrollo de la Bioinformática.

 Acumulación de gran cantidad de

conocimiento en grandes bases de datos
 EVOLUCIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA
Cuarta etapa de desarrollo

Medicina
Personalizada Cuarta
Genómica Terapia génica

Proteómica
Tercera
Segunda
Primera

Inicio de la Finales Primera mitad Finales Principio

civilización Siglo XIX Siglo XX Siglo XX Siglo XXI

Tiempo
2. Definición de biotecnología, ciencias que
sustentan la biotecnología
 BIOTECNOLOGIA

El prefijo “BIO” se refiere a bacterias,

levaduras y otras células vivas, así como a
componentes de estas células.

La “TECNOLOGIA” consiste en el uso de

biorreactores para el cultivo de
microorganismos o células, conectados a
sus fuentes de alimentación y oxígeno
mediante una intrincada red de válvulas que
se cierran y abren según los ritmos que
marca una computadora.
DEFINICION

Aplicación de los principios

científicos y de la ingeniería al
procesamiento de materiales por
agentes biológicos para proveer
bienes y servicios.

Organización de Cooperación y Desarrollo

Económicos
• Cúmulo de técnicas basadas en la
manipulación de procesos moleculares y
celulares, y su empleo con el objeto de
obtener nuevos procesos y productos.

• Uso de organismos vivos o de

compuestos obtenidos de organismos
vivos para obtener bienes y servicios para
el hombre.
 LA BIOTECNOLOGIA

Estudia el empleo de organismos vivos en la obtención

de un bien o servicio útil para el hombre
La Biotecnología es Interdisciplinar

La biotecnología además de depender

enormemente de la selección de materia
prima y de la ingeniería genética, por ser
interdisciplinaria depende de muchas ramas
tales como:
Microbiología, bioquímica, biología celular,
medicina, ingeniería mecánica, ciencia y
tecnología de alimentos, electrónica e
informática, entre otras.
PRINCIPIOS CIENTIFICOS Y DE LA
INGENIERIA:

Conjunto amplio de disciplinas

que ponen especial énfasis en la
Microbiología, Bioquímica,
Biología Molecular, Genética,
Inmunología e Ingeniería
Bioquímica y Química.
 La biotecnología incluye conocimientos y
herramientas provenientes de distintas disciplinas:

Biología
Celular Inmunología
y y
Cultivo de
Biología Virología
Tejidos Bioquímica
Molecular

Biotecnología

Producción de Recuperación de
Salud
Agricultura alimentos Area Ambiental metales

Es una herramienta productiva que ha impactado prácticamente en todas las

actividades industriales.
 AMBIENTAL
Biorremediación
Monitoreo ambiental
Control de la polución

AGROPECUARIO MEDICINA
APLICACIONES UTILES
Diagnóstico
Rendimiento de cosechas
Calidad de Vacunas
alimentos Terapéutica
Salud animal

Biosensores Cultivo de células y tejidos

Bioprocesos Ingeniería genética
HERRAMIENTAS BIOTECNOLOGICAS
Antisentido Anticuerpos monoclonales
Ingeniería de proteínas

Bioquímica Biología Celular

Ingeniería Inmunología
Bioquímica CONOCIMIENTO CIENTIFICO Computación
Microbiología Genética
Biología Molecular Fisiología
La biotecnología, un nuevo paradigma
tecnológico, cuyo rol estratégico se deriva de:
 Su naturaleza multidisciplinaria, convergencia y
sinergia con otros desarrollos tecnológicos de punta:
informática, nanotecnología, tecnología de los
materiales, etc

 Su carácter genérico, abarcativo de una amplia gama

de sectores y servicios

 Los impactos sistémicos sobre el entramado

económico

 Su importancia para la generación de ventajas

competitivas: desarrollo de productos de mayor valor y
calidad, disminución de tiempos y costos de
producción; diversificación productiva
A nivel internacional

 Desarrollos concentrados en un reducido número

de países y grandes empresas transnacionales

 Asociados a innovaciones institucionales

(patentamiento, mercados de capitales…) y al
surgimiento de firmas especializadas en I+D
 Dinámica competitiva y de expansión reciente a través
de :

i) alcanzar economías de escala y controlar activos

complementarios y redes de comercialización;

ii) conformación de alianzas estratégicas pre competitivas

público/privadas, debido a los altos umbrales de inversión
en I+D y los riesgos asociados a estas producciones
(alianzas fuertemente asimétricas)

 Aspectos críticos: contexto regulatorio e institucional

(control y monitoreo) ; financiamiento de la I+D
(capitales de riesgo, aportes públicos); manejo de
riesgos y beneficios asociados a estas tecnologías;
bioseguridad y bioética, apropiabilidad privada de los
conocimientos…..
TÉCNICAS USADAS EN BIOTECNOLOGÍA
 Cultivo de tejidos: Trabaja a un nivel superior a
la célula e incluye células, tejidos y órganos
que se desarrollan en condiciones
controladas.

 Tecnología del ADN: Involucra la manipulación

de genes a nivel del ADN, aislamiento de
genes, su recombinación y expresión en
nuevas formas, etc.
 RAMAS DE LA BIOTECNOLOGÍA

 Biotecnología en Salud Humana.( donde

se incluye la B. Alimentaría)
 Biotecnología Animal.
 Biotecnología Industrial
 Biotecnología Vegetal
 Biotecnología Ambiental
CATEGORIZACION Y APLICACIONES DE LA
BIOTECNOLOGIA

http://www.cedaf.org.do/cedaf/impulsabio/documentos.htm
 BIOTECNOLOGÍA

Sin un conocimiento y desarrollo

en ciencias básicas
no es posible realizar desarrollos
en biotecnología.

Invertir en educación científica

es el pilar de la generación de
nuevos desarrollos
biotecnológicos.
 BIOCIENCIAS
El modelo productivo se está basando en la
biología, antes lo fue en la química y en la física.

 Bioderecho
 Bioética
 Bioinformática
 Bioeconomía
 Biofilosofía
Direcciones Electrónicas:
 What is Biotechnology?
 http://www.accessexcellence.org/RC/AB/BC/what_is_biotechnology.html

 Biotech Examples
 http://w3.ouhsc.edu/biotechhighschool/examples.html

 Life Sciences in the 21st Century: Biotechnology

 http://www.isis.vt.edu/~nstone/LifeSci/lect5.html

 Stem Cells
 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/S/Stem_Cells.html

 http://www.pbs.org/newshour/health/stem_cells.swf

 http://learn.genetics.utah.edu/units/stemcells/whatissc/

 Transgenic Crops – An Introduction and Resource Guide

 http://generalhorticulture.tamu.edu/LearningCommunity/Assignments/Transg
enicCrops/TransgenicCrops.htm
3. Avances y tendencias
BIOTECNOLOGIA Y DESARROLLO DE
ALIMENTOS

Perspectivas en el desarrollo de
alimentos funcionales y transgenicos
 La Biotecnología en la alimentación:

 Solución de problemas de
alimentación-nutrición

 Proporciona Alimentos con

características funcionales - salud
 LA BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA
 Es utilizada en la producción, transformación y

conservación de alimentos,

 En la producción de materias primas, aditivos y

auxiliares utilizados en la producción de alimentos,

 En el desarrollo de métodos de análisis, control de

calidad y biosensores.

Compuestos bioactivos: Biotec. Vegetal,

animal o industrial (tecnologìa enzimática y/o
fermentación).
 DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA Y LOS ALIMENTOS
FUNCIONALES (COMPUESTOS BIOACTIVOS)

 Avances en selección y mejoramiento: mutaciones y

la tecnología del rADN,

 Mayores conocimientos en fisiología y crecimiento

celular; así como el desarrollo de la bioingeniería:
técnicas de fermentación y biorreactores más
performantes,

 Desarrollo de nuevas técnicas de recuperación y

purificación.
ALIMENTACION Desnutricion

• La población mundial para el 2025 se estima en 8

mil millones de personas

• El incremento de hambre y la pobreza es cada vez

mayor. Mas de 40,000 personas mueren
diariamente por problemas de alimentación
Propuestas para aumentar la producción de
alimentos:

• Aumentar la superficie cultivada y/o

intensificar los sistemas de riego
¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡

• Aumentar los rendimientos de

producción
 LA BIOTECNOLOGIA OFRECE:

 Nuevas alternativas para la producción de materias primas e

ingredientes

 Ofrece productos de mayor funcionalidad

 Facilita el procesamiento

 Ofrece productos con mejores características sensoriales

 Ofrece productos con mayor tiempo de vida útil

 Mejora o provee características funcionales/nutraceúticas

 EL MEJORAMIENTO GENETICO.............

Biotecnología Tradicional: Biotecnología Moderna:

Técnicas utilizadas a lo
largo de la historia,
mediante el cruzamiento
de organismos cercanos,
en procesos
relativamente largos, que
generan nuevas
variedades genéticas.
se refiere a dos grandes
tipos de técnicas: el ADN
recombinante y la fusión
celular, que permiten el
traslado de genes de un
organismo a otro, sea o no
de la misma especie,
produciendo como resultado
un organismo
genéticamente modificado
(OGM).
 LA BIOTECNOLOGIA VEGETAL rADN:

 Reduce el uso de agro-químicos

 Mejor control de enfermedades
 Mayores rendimientos de producción
 Producción más eficiente
 Contribuye a una agricultura global y
sostenible
 Incrementa la disponibilidad de alimentos en
el mundo
 Objetivos de la tecnologia de rADN
•Aumentar el rendimiento
• Mejorar la capacidad productiva

• Mejorar la resistencia a plagas y condiciones ambientales

adversas
• Mejorar las características tecnológicas, a través de
variedades que se adapten a la exigencias y aplicación de
tecnologías para su preservación y transfromación

• Mejorar la calidad
• Mejorar las características nutricionales y funcionales
• Domesticar nuevas especies
• Adaptar variedades a nuevas zonas geográficas
 PLANTAS TRANSGENICAS

 Mejor manejo y control de plagas

PRESENTE
 Beneficios
• Desde un punto de vista agronómico
• Desde un punto de vista del consumidor
 Usos no tradicionales

FUTURO
• Enzimas, compuestos biactivos y
productos industriales
• Farmaceuticos
• Vacunas
Principales cultivos transgénicos
•Maíz Bt
•Algodón Bt
•Papas Bt
•Soya “Roundup Ready”
•Maíz “Roundup Ready”
•Algodón “Roundup Ready”
•Maíz “Liberty Link”
•Algodón BXN
 Plantas resistentes

• Virus
Plagas y enferemedades • Insectos
• Herbicidas

• Sequias,

 Condiciones ambientales • Heladas,

• Suelos salinos,
adversas •Suelos ácidos,
• etc...
 Tomate “Flavr savr”
 Se ha inhibido la producción de
poligalacturonasa (gen antisentido):

•Previene el ablandamiento
•Mayor contenido de solidos solubles

Industrial Ketchup y pasta

Usos:
Escaso consumo fresco
 Desarrollo adecuado de las

características sensoriales en

frutas y vegetales

Prevención de la

producción de etileno
4. Generalidades sobre industrias de procesos
biotecnológicos
 PRODUCTOS
NUTRACÉUTICOS
NUTRACÈUTICOS

Productos de origen natural con propiedades

biológicas activas, beneficiosas para la salud y
con capacidad preventiva y/o terapéutica definida
Los nutracéuticos son productos que
ocupan el gran espacio existente entre el
ALIMENTO y el MEDICAMENTO
 Nutracéuticos

Acción preventiva

Alimentos
Alimentos NUTRACÉUTICOS Medicamentos
Funcionales

Acción terapéutica

Química
Origen natural de
síntesis
 Categorización general

 Productos Naturales  Productos Naturales  Tratamiento habitual

PROS +  Bajo coste  No desnaturalización  Conocimiento
 Nutrientes básicos  Propiedades medicinales  Credibilidad

 Desnaturalización  Costes  Toxicidad

CONS -  Contaminación  Déficit legislativo  Efectos secundarios
 Infecciones  Desconocimiento  Costes
 Nutracéuticos

Fuente Mecanismo Naturaleza

alimentaria de acción química

Especies animales Organismos

Plantas
terrestres o marinas microbianos

Ácido Linoleico Beta-glicano

Ácido Eicosapentanoico Ácido ascórbico Saccharomyces boulardii
Ácido Decosahexanoico Gamma-tocoferol Bifidobacterium bifidus
Esfingolípidos Guercetina Bifidobacterium longum
Colina Celulosa Bifidobacterium infantis
Lecitina Luteína Lactobacillus acidophilus
Calcio Ácido gálico Strepcococcus salvarius
Ubiquinona Potasio
Lipoproteínas Beta-ioneno
Fosfolípidos Alfa-tocoferol
Beta-caroteno
Selenio
 TRATAMIENTO DE RESIDUOS
AGROINDUSTRIALES
¿Que tipos de proyectos hay en la agroindustria?
• Manejo de residuos
• Aprovechamiento energético de residuos
 Residuos orgánicos agroindustriales:
materias primas

Agrícolas
 Excedentes de cultivo (retirada).
 Descartes baja calidad.

Industria alimentaria
 Restos de materia prima (vegetal o animal).
 Productos intermedios o finales desechados.
 Lodos de depuración.

Distribución alimentaria
 Caducados, retirados.

Ganaderos
 Estiércol de vaca.
 Purín de cerdo.
Otros
 Residuos orgánicos domésticos.
 Glicerina.
proceso
Procesamiento de residuos :
residuo1 Pre-tratamiento
Mecánico
Térmico
residuo2 Biológico

residuo3
Co-digestión Anaerobia Digerido
En Digestores
(€?) (vertical u horizontal)
residuoN Almacenamiento
Tanques

MEZCLA Biogás Acondicionado

EQUILIBRADA!!! Aplicación como Fertilizante (€)
Sólido o Líquido
Depuración H2O y H2S

Combustión
En motor co-generación

venta a la
Calor (€) Electricidad (€) red eléctrica

Calefacción, secado, …
 Aprovechamiento energético :
bioenergía

BIOENERGÍA

BIOMASA

BIOCOMBUSTIBLES BIOCOMBUSTIBLES
BIOGAS
SÓLIDOS LÍQUIDOS

BIODIESEL BIOETANOL

Energías
Renovables
El proyecto de la Granja San Ramón.

Campo
TRITURACIÓN Cooperativas
Industria
ENSILADO* RESIDUO CÍTRICO

ESTIERCOL
DIGESTADO
SEPARACIÓN S/L COMPOSTAJE
SÓLIDO
LIQUIDO
CO-DIGESTIÓN AGUA DE RIEGO* ABONO ORGÁNICO

Granja
BIOGAS

ACONDICIONADO
CO-GENERACIÓN
Venta a la red

CALOR ELECTRICIDAD

AINIA, Programa Nacional de Energía. España

La alegría de ver y entender es el más perfecto don de la naturaleza

Albert Einstein
70
 UNIDAD II

Bases Biológicas de la Biotecnología

1. Estructura celular de procariotas y
eucariotas.
 CELULA EUCARIOTA Y PROCARIOTA

Células procariotas
Células eucariotas

ARN
Virus ADN
CELULAS: ANIMAL Y VEGETAL
 EL GENOMA

Es la suma total del material genético presente en

un organismo particular, incluye el ADN presente
en los cromosomas y en los organelos
subcelulares (ej., mitocondrias) y el genoma de
ARN de algunos virus.

GENÓMICA: estudio del genoma y su acción.

El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador

del genoma humano en un 90%, marcó un hito
histórico para la humanidad.
 Proyecto Genoma Humano se inició en 1986.
 En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación
de 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb).
 Los genes representan el 2% del genoma humano.
 Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%
60%

De 289 genes
IDENTIDAD GENÉTICA 20%
humanos
implicados en
enfermedades,
70% hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
95% idéntico
Drosophila.

Humanos Chimpancé Ratón A. thaliana C. elegans D. melanogaster

30,000 30,000 30,000 25,000 19,000 13,000
genes genes genes genes genes genes

R. ALEGRÍA CONACYT 2002

BASES MOLECULARES ADN ADN
genoma
DE LA VIDA
ARN
Célula
cromosomas
PROTEÍNAS
genes
los genes
contienen
instrucciones
para hacer
ADN
proteínas

proteínas

las proteínas actúan

solas o en complejos
para realizar las
funciones celulares
Métodos utilizados en la genómica incluyen:

•Genómica Estructural. Estudio de que secuencias de genes están

presentes dentro del ADN de un organismo.

•Genómica Funcional. El estudio de que funciones son conferidas a un

organismo por una secuencia génica dada.

•Genómica Química. Se usa para comparar dos organismos de la misma

especie (uno de los cuales tiene un gen o genes inactivados por un
químico específico o una mutación puntual.

•Análisis de la Expresión Génica. Se usa para determinar el producto o

productos producidos (tales como una enzima u otra proteína crítica).
Cuando un determinado gen es activado, se mide la fluorescencia de las
moléculas de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm
hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las proteínas
producidas/analizadas, que están adheridas a la superficie de
hibridización sobre un biochip).
ESTRUCTURA Y CARACETRISTICAS DEL GENOMA

Ácidos nucleícos

 Azúcar

 Base nitrogenada

 Enlace Fosfodiéster
 Los azúcares

desoxirribosa
Enlace del azúcar con la base

ribosa
 Las bases nitrogenadas
 El ácido fosfórico

El ácido fosfórico es un tri-ácido. Dos de las tres funciones

ácido serán esterificadas en el ADN y ARN.

Enlace
Fosfodiester
Estructura y características del ADN
Azúcar  desoxiribosa

Bases  A, G, C y T

Dos cadenas:
 antiparalelas
 complementarias
 helicoidales
EXPRESION DEL GENOMA
Código Genético ADN
1)

La información
genética está
almacenada en el
ADN 2) Transcripción

ARNm
Doble hebra

3)
Traducción

Todos los seres vivos comparten el

mismo código genético,
El “lenguaje” en el que se especifican
las instrucciones para la síntesis de Aminoácidos
proteínas.
 Molécula
GEN de
ADN

 Segmento de ADN que

codifica para un polipéptido o
para una molécula funcional
de ARN. (DT)

 Secuencia de ADN genómico o de ARN que

es esencial para especificar una determinada
función. Para llevar a cabo su función el gen no
necesita ser traducido a proteína, y a veces ni
siquiera necesita ser transcrito. (DA)
 ESTRUCTURA DE UN GEN
•Elementos típicos:

1) región reguladora
 promotor basal (caja TATA).
 sitios de unión de proteinas reguladoras
(upstream promoter).
 Realzadores (enhancers)
 Silenciadores

2) sitio de inicio de transcripción.

3) 5'UTR.

4) codón de inicio.

5) intrones y exones alternados, con sitios de

procesamiento aceptores y donadores

6) Codón de paro.

7) 3'UTR.

8) señal de poli-adenilación.
 ESTRUCTURA DE UN GEN

Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico

Promotores Realzadores

Exones Intrones
Sitio de inicio de Sitio de terminación
la Transcripción < 100 Kb de la Transcripción

La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las
ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias
promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras
específicas).
Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estímulos del entorno del organismo.
 LOS GENES SON SEGMENTOS DE ADN
 Su expresión está controlada por segmentos
reguladores (promotores, potenciadores, terminadores).
 La información contenida y almacenada en los genes se
expresa como proteínas.
 La proteína codificada por un determinado gen
contribuye a la expresión de un caracter específico.

ADN

RNAm Proteína caracter

Traducción
Expresión
Transcripción
 EL DOGMA CENTRAL

Transcripcion
inversa

 La información fluye del ADN al ARN y de éste a las proteínas.

 Existe un proceso inverso a la transcripción llamado transcripción

inversa, en el cual la información codificada por ciertos virus que
contienen ARN se transcribe al ADN por la acción de la enzima
transcriptasa inversa.
 El Dogma Central

DNA

RNA

Proteína
EL DOGMA CENTRAL
 LA REPLICACIÓN DEL ADN
 La división celular requiere de la duplicación del material
genético

mitosis

meiosis

mitosis
LA REPLICACIÓN DEL ADN
Mecanismo general

 La misma estructura del ADN

sugirió un mecanismo de
replicación de la información

 Cada hebra sirve como molde

para replicar la
complementaria
Propiedades
 Semiconservativa: cada nueva molécula esta formada
por una hebra parental y una recién sintetizada.

Experimentos de Meselson y Stahl

 Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de
inicio denominado origen de replicación

 A cada lado de la burbuja de replicación se forma una

horquilla de replicación
 Dirección de la síntesis: 5’ 3’
 Semidiscontinua: Una de las hebras no puede
ser sintetizada de continuo
 Consecuencia de la direccionalidad
Mecanismo de Replicación (procariotas)
 Inicio
 Reconocimiento de orígenes de replicación.
 Separación de hebras.
 Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

 Elongación
 Crecimiento bidireccional de las horquillas de
replicación.
 Replicación semiconservativa, semidiscontinua,
coordinada.

 Terminación
 Reconocimiento de señales de terminación.
 Desensamble de replisomas.
 ADN polimerasas:
 Pol I
 Pol II
 Pol III (replicasa)
 Pol IV y V
 Necesitan 3’ OH libre
 Maquinaria enzimática
 ADN polimerasas: Síntesis de ADN

 Primasas: Generación 3’OH libres

 Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki

 Helicasas: Separación de hebras

 Topoisomerasas: Mantenimiento del grado de

superenrollamiento

 SSBs: Mantenimiento de simples hebras

Inicio:
 Reconocimiento del
origen y apertura de las
hebras
 Elongación

 Primasa:
 Sintetiza fragmentos de
ARN (cebadores) que
provean los 3’ OH libres
 Puede comenzar sin
necesidad de cebador
Replisoma
Horquilla eucariota
Terminación
LA REPLICACIÓN DEL ADN
Alargamiento de los extremos de los
cromosomas eucarióticos por la enzima
telomerasa.
 TRANSCRIPCION
 La transcripción del ADN es el
primer proceso de la expresión
génica, mediante el cuál se
transfiere la información
contenida en la secuencia del
ADN hacia la secuencia de
proteína utilizando como
intermediario el ARNm.

 Síntesis enzimática de RNA

utilizando una molécula de DNA
como templado.

 La enzima que realiza esta

síntesis es la RNA polimerasa.
El ARN mensajero

 Las moléculas de ARNm son

copias o transcriptos de secuencias
de 500 a 10000 nt de una de las dos
cadenas de ADN.

 Las secuencias de ADN

transcriptas corresponden a
secuencias codificantes llamadas
GENES.

 La transcripción es catalizada por

la enzima ARN polimerasa.

 Síntesis de 5’  3’, el ARNm es

antiparalelo a la cadena de ADN
Preiniciación:

 Antes del inicio de la

Transcripción se
necesitan toda una serie
de factores de
transcripción que ejercen
de factores de iniciación,
que se unen a
secuencias específicas
de ADN para reconocer
el sitio donde la
transcripción ha de
comenzar
ETAPAS DE LA TRANSCRIPCION
1. Iniciación: Una ARN-polimerasa comienza la síntesis del
precursor del ARN a partir de unas señales de iniciación
"secuencias de consenso " que se encuentran en el ADN.

ARNpolimerasa

T A C G A A C C G T T G C A C A T C
A U G C U U G G C A A C G U G
2. Alargamiento: La síntesis de la cadena continúa en
dirección 5'3'. Después de 30 nucleótidos se le añade al
ARN una cabeza (caperuza o líder) de metil-GTP en el
extremo 5‘ con función protectora.

ARNpolimerasa

T A C G A A C C G T T G C A C A T C
C
A U G C U U G G C A A G U G

m-GTP
3. Finalización: Una vez que la enzima (ARN polimerasa)
llega a la región terminadora del gen finaliza la síntesis del
ARN. Entonces, una poliA-polimerasa añade una serie de
nucleótidos con adenina, la cola poliA, y el ARN, llamado
ahora ARNm precursor, se libera.

poliA-polimerasa

m-GTP A U G C U C G U G U A G A A A A A

ARNm
precursor
4. Maduración : El ARNm precursor contiene tanto
exones como intrones. Se trata, por lo tanto, de un ARNm
no apto para que la información que contiene sea
traducida y se sintetice la correspondiente molécula
proteica.

Cabeza cola
ARNm AAAAAA
maduro
precursor AUG UAG

En el proceso de maduración un sistema enzimático

reconoce, corta y retira los intrones y las ARN-ligasas
unen los exones, formándose el ARNm maduro.
Maduración del ARNm

Región codificadora del gen

ADN
Promotor E1 I1 E2 I2 E3 Terminador

TAC ATC

Cabeza E1 I1 E2 I2 E3 cola
ARNm AAAAAA
precursor AUG UAG

Cabeza cola
ARNm
maduro AAAAAA
AUG UAG
 Splicing del gen de ovoalbúmina

Gen de Ovoalbúmina
L 1 2 3 4 5 6 7
DNA A B C D E F G

L 1 2 3 4 5 6 7
Transcrito
primario A B C D E F G

Cap Edición, rompimiento

y poliadenilación

7 intrones RNA extra

12 3 4 5 6 7
AAAAn
RNa maduro 1.872
nucleótidos
TRANSCRIPCIÓN PROCARIOTAS
Transcripción Inversa

 Transcripción inversa o retrotranscripción es un

proceso de la biología molecular que implica la
generación de una cadena de ADN a partir de una
cadena de ARN
 TRADUCCIÓN

Proceso por el que la secuencia de nucleótidos de un

ARNm determina la estructura primaria de una proteína
 TRADUCCIÓN
 Es la síntesis de una molécula de proteína, de
acuerdo con el código contenido en la molécula de
ARNm.

 Se llama traducción porque comprende el cambio

del “lenguaje” de ácidos nucleicos (sucesión de
bases) al lenguaje de proteínas (sucesión de
aminoácidos).

 En el citoplasma, el ARNm se mueve hacia los

ribosomas. Los aminoácidos que se necesitan están
dispersos por el citoplasma. Los aminoácidos
correctos llegan al ARNm por el ARNt.
 Las moléculas de ARNt son más cortas que las de ARNm
y tienen la forma de una hoja de trébol.
 En uno de los lazos de la molécula de ARNt hay un
conjunto de tres bases llamado anticodón. El lado opuesto
transporta un aminoácido.
 Las bases de los anticodones del ARNt son
complementarias a las bases de los codones del ARNm.
ELEMENTOS DE LA TRADUCCIÓN
Tipos de ARN
 ARN mensajero o ARNm: lleva las instrucciones para
hacer una proteína en particular, desde el ADN en el
núcleo hasta los cromosomas.
 ARN de transferencia o ARNt: lleva los aminoácidos a los
ribosomas, se encuentra en el citoplasma.
 ARN ribosomal o ARNr: forma parte de los ribosmas.
 La traducción del mensaje genético ocurre en los
ribosomas.

 La unidad ARNm - ribosomas es la máquina molecular

que realiza la síntesis de proteínas.
Primer aminoácido de la
proteína naciente

Aminoacil-ARNt


ARN mensajero

Codón de inicio AUG

http://library.thinkquest.org/04apr/00217/images/content/ribosom
 El ribosoma se desplaza sobre la molécula de
ARNm y se van agregando aminoácidos a la
cadena peptídica

http://www.plyojump.com/courses/biology/images/ribosome_making%20pro
 Varios ribosomas se unen sucesivamente al ARNm
 Un polipéptido se forma con cada ribosoma

http://www.palaeos.com/Eukarya/Lists/EuGlossary/Images/Ribosom
 LAS ETAPAS DE LA TRADUCCIÓN
Iniciación
Elongación

Terminación
Iniciación: La subunidad pequeña del ribosoma se une a la región líder del ARNm y el ARNm se
desplaza hasta llegar al codón AUG, que codifica el principio de la proteína. Se les une entonces el
complejo formado por el ARNt-metionina (Met). La unión se produce entre el codón del ARNm y el
anticodón del ARNt que transporta la metionina (Met).

Subunidad menor del ribosoma

P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AA
UG UU CG UA
C Codón
A A G
UA
C
Anticodón
ARNt ARNm

1er aminoácido
Elongación I: A continuación se une la subunidad mayor a la menor completándose el ribosoma.
El complejo ARNt-aminoácido2 , la glutamima (Gln) [ARNt-Gln] se sitúa enfrente del codón
correspondiente (CAA). La región del ribosoma a la que se une el complejo ARNt-Gln se le llama
región aminoacil (A).

Subunidad menor del ribosoma

P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG UU CG UA
UA GU C A A G
C U
Elongación II: Se forma el enlace peptídico entre el grupo carboxilo de la metionina (Met) y el
grupo amino del segundo aminoácido, la glutamina (Gln).

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
UA GU C A A G
C U
Elongación III: El ARNt del primer aminoácido, la metionina (Met) se libera.

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
GU C A A G
U
Elongación IV: El ARNm se traslada, de tal manera que el complejo ARNt-Gln-Met queda en
la región peptidil del ribosoma, quedando ahora la región aminoacil (A) libre para la entrada del
complejo ARNt-aa3

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
GU C A A G
U
Elongación V: Entrada en la posición correspondiente a la región aminoacil (A) del complejo
ARNt-Cys, correspondiente al tercer aminoácido, la cisteína (Cys).

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
GU ACC A A G
U G
Elongación VI: Unión del péptido Met-Gln (Metionina-Glutamina) a la cisteína (Cys).

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
GU ACC A A G
U G
Elongación VII: Se libera el ARNt correspondiente al segundo aminoácido, la glutamina
(Glu).

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
A
CC A A G
G

(i)
Elongación VIII: El ARNm corre hacia la otra posición, quedando el complejo ARNt3-Cys-
Glu-Met en la región peptidil del ribosoma.

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
A
CC A A G
G
Elongación IX: Entrada del complejo ARNt-Leu correspondiente al 4º aminoácido, la leucina.

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
A
CC A A G
G AA
U

Leu
Elongación X: Este se sitúa en la región aminoacil (A).

P A ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG UU CG UA
A
CC AA
A A G
G U
Elongación XI: Unión del péptido Met-Gln-Cys con el 4º aminoácido, la leucina (Leu).
Liberación del ARNt de la leucina. El ARNm se desplaza a la 5ª posición

ARNm P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
C AA
A A G
U
Elongación XII: Entrada del ARNt de la leucina, el 5º aminoácido, la arginina (ARNt-Arg).

ARNm P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
C AA
A A G
U GC
U
Elongación XIII: Unión del péptido Met-Gln-Cys-Leu con el 5º
aminoácido, la arginina (Arg). Liberación del ARNt de la leucina
(Leu). El ARNm se desplaza a la 6ª posición, se trata del un codón de
finalización o de stop.

ARNm P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
C A GC G
A
U

Arg-Leu-Cys-Gln-
Met
Finalización I: Liberación del péptido o proteína. Las subunidades del ribosoma se disocian y
se separan del ARNm.

ARNm P A
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C AU
AG U U CG UA
C A GC G
A
U

Arg-Leu-Cys-Gln-
Met
Finalización II: Después unos minutos los ARNm son digeridos por las enzimas del
hialoplasma.

ARNm
5’ AAAAAAAAAAA 3’

A U G C A A U G C U U A C GA U A G
EL PROCESO DE LA TRADUCCIÓN
 LOS EFECTORES DE LA TRADUCCIÓN
ARN ribosómicos (ARNr)
ARN de transferencia (ARNt)
LOS EFECTORES DE LA TRADUCCIÓN
EL CÓDIGO GENÉTICO
 LOCALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
La síntesis de proteínas comienza siempre en ribosomas libres en el citosol y señales
presentes en la cadena polipeptídica determinan las modificaciones posteriores y su
localización final. Las proteínas destinadas al sistema de endomembranas (retículo
endoplásmico, complejo de Golgi o lisosomas), a la membrana plasmática o de
exportación se sintetizan en ribosomas que se asocian transitoriamente a membrana
del retículo endoplásmico y son translocadas al lúmen donde se les agrega una cadena
corta de azúcares. La glucosilación de las proteínas finaliza en el complejo de Golgi,
donde son clasificadas y empaquetadas en vesículas que las conducen a su
localización final.
 UNIDAD III

INGENIERIA GENETICA
(TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE)
 TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
 El estudio de los numerosos métodos mediante los cuales las células
procesan, añaden, eliminan y transfieren información genética, abrió el
camino para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas.

 La tecnología del DNA recombinante ha hecho posible investigar más

a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los genes
eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos.

 En investigaciones iniciales del DNA recombinante, se evidenció que

los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente
las de importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y
ser expresados.

 Las bacterias pueden funcionar como « fábricas » que suministran

una fuente virtualmente ilimitada de proteínas. Esta propiedad de las
bacterias fue aprovechada por los científicos para desarrollar la
Biotecnología.
Etapas que se llevan a cabo en ingeniería
genética :

1. Aislamiento de una secuencia de ácido nucleíco (gen)

2. Inserción de este gen en un vector (plásmido, fago etc...)

3. Incorporación de este vector en un huésped (E. coli,

células eucariotas)

4. El huésped así transformado puede asegurar la

propagación de la información genètica modificada
mediante la replicación (clon).

5. En ciertos casos será posible hacer traducir (se dice

expresar) la secuencia genética insertada y amplificada,
que será entonces funcional fuera del organismo del cual
ha sido inicialmente extraído.
Aislamiento de fragmentos específicos de
DNA

Dos tipos de procedimientos enzimáticos son

utilizados. Ciertas enzimas cortan el ADN en
fragmentos; son las enzimas de restricción. Otras
enlazan entre ellos fragmentos de ADN, son las
ligasas.

ELECTROFORESIS
Enzimas de restricción:

 También conocidas como endonucleasas, cortan los

enlaces fosfodiester a partir de ua secuencia que
reconocen.
 La secuencia que reconocen es una secuencia
palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas
direcciones).
 Son extraídas de bacterias, donde actuan como
mecanismo de defensa para degradar material genético
extraño que entre en la célula.
 Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII y
EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen:

EcoRI: E = género Escherichia.

co = especie coli
R = cepa RV 13
I= primera endonucleasa aislada de
esta cepa
Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir
dos tipos de cortes:

 Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en

dos puntos diferentes.

 Abruptos: cortan en un sólo punto.

 Enzimas de restricción
Secuencias de corte de algunas enzimas de restricción

Enzima Secuencia Enzima Secuencia

Eco RI GAATTC Nar I GGCGCC
Bcl I TGATCA Nae I GCCGGC
Nco I CCATGG Sma I CCCGGG
Bam HI GGATCC Acc III TCCGGA
Alu I AGCT Taq I TCGA
Hae III GGCC Mae II ACGT
Apa I GGGCCC Mae I CTAG
Not I GCGGCCGC Nde I CATATG
Bal I TGGCCA Ssp I AATATT
Hind III AAGCTT Spe I ACTAGT
Cfo I GCGC Swa I ATTTAAAT
Las ligasas permiten el enlace entre fragmentos de ADN. Los diferentes
procesos de ligación (de extremidades cohesivas producidas después de
la digestión con enzimas de restricción, por utilización de moléculas de
junción o por el método de adición de secuencias hompoliméricas
complementarias) son descritos más adelante. Son estos diferentes
procesos que las secuencias aisladas son insertadas en los vectores para
constituir una molécula recombinante, llamada híbrido o químero.
El método actualmente el más utilizado para obtener
secuencias genéticas consiste en preparar el mensajero
específico de un gen, transcribirlo de manera inversa
(gracias a la transcriptasa inversa) en ADN complementario
(ADNc), y a hacerlo doble cadena.
Multiplicaciòn de DNA
 La maquinaria para duplicar DNA está presente en la E. coli y
en otras células bacterianas.

 Pero hacían falta vectores que pudiesen llevar las moléculas

de DNA de interés al interior de estas células e iniciar la
replicación. Nuevamente, los procariotas y los virus aportaron
la solución.

 Los clones, en genética molecular, son copias múltiples de la

misma secuencia de DNA. Las secuencias a ser clonadas se
introducen en células bacterianas por medio de vectores.
 Los plásmidos y los bacteriófagos se usan como vectores;

 Los cósmidos son vectores sintéticos que combinan características

del fago lambda (que tienen los extremos cohesivos o regiones
COS) con propiedades de los plásmidos.

 La secuencias de DNA que se desean clonar deben ser insertadas

en los vectores. Una vez en la bacteria, el vector y el DNA extraño
que lleva se replican y las copias múltiples pueden ser recuperadas
de las células.

 Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca

genómica que consiste en una colección de fragmentos de DNA
genómico clonados en vectores (plásmidos, bacteriófagos o
cósmidos), que representan el genoma entero del organismo.

 Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA que representan la

colección completa de los mRNA que se sintetizan en un momento
en una célula dada.
Obtención de múltiples copias de DNA
Plásmidos Bacteriófagos Cósmidos
PLÁSMIDOS

Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circular

covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas de origen natural
que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replican
autónomamente en las células bacterianas.

¿Porqué son empleados como vectores?

Porque son:

 Pequeños.
 Producen múltiples copias.
 PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO

GEN LACZ
(MARCADOR
DE
GEN DE SELECCIÓN)
RESISTENCIA
AL
ANTIBIÓTICO
(MARCADOR SITIO DE
DE CLONADO
SELECCION) MÚLTIPLE

ORIGEN DE
REPLICACION
Estructura de los Plásmidos :
COMPONENTES:

1. ORIGEN DE REPLICACIÓN
2. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las bacterias que
contienen el plásmido; ej. ampicilina)
3. SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
4. PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)
5. SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)

PARA LA EXPRESIÓN DE PARA LA EXPRESIÓN PARA LA

LA PROTEÍNA EN CÉLULAS DE LA PROTEÍNA EN AMPLIFICACIÓN DEL
DE MAMÍFEROS BACTERIAS GEN EN BACTERIAS

6. GEN REPORTERO
7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las células que
hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej. neomicina)
Plásmidos como vectores de expresión:
Plásmidos de expresión en bacterias
Plásmidos de expresión en bacterias: proteínas de fusión
Plásmidos de expresión en células de mamíferos
CLONACION CON PLÁSMIDOS: GEN LACZ

SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE

AMPR

ORIGEN DE
REPLICACIÓN
 PRODUCTO DE PCR

DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y

DEL FRAGMENTO DE ADN CON
LA MISMA ENZIMA DE
PLÁSMIDO DE CLONADO RESTRICCION
 PRODUCTO DE PCR

EcoRI EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
PLÁSMIDO DE CLONADO
 PRODUCTO DE PCR
DIGERIDO CON EcoRI

PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGERIDO CON EcoRI

DIGESTIÓN CON LA MISMA

ENZIMA DE RESTRICCION
Ligación:

ADN LIGASA
¿CON QUÉ?

ADN LIGASA
TUBO CON MEZCLA DE
FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON
EcoRI
 DOS
RESULTADOS
POSIBLES ….
PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE

PLÁSMIDO RECOMBINANTE
 Transformación bacteriana:

TUBO CON MEZCLA DE TUBO CON CULTIVO

PLÁSMIDOS LÍQUIDO DE BACTERIAS
RECOMBINANTES Y NO
RECOMBINANTES
  BACTERIA NO
TRANSFORMADA
DOS RESULTADOS
POSIBLES ….

 BACTERIA
TRANSFORMAD
A
 Siembra placas con medio agar lb suplementado
con ampicilina, iptg y x-gal:
 Incubación a 37°c por 16 horas:
 Tres resultados posibles:

A. BACTERIA NO
TRANSFORMADA

EN UN MEDIO
CON AMPICILINA

LA BACTERIA SIN
PLÁSMIDO NO CRECE
B.
BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
NO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ INTEGRO) ES AZUL
C.
BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
RECOMBINANTE

EN UN MEDIO EN UN MEDIO
CON AMPICILINA CON IPTG Y Xgal

LA BACTERIA CON PLÁSMIDO

LA BACTERIA CON
NO RECOMBINANTE (GEN
PLÁSMIDO CRECE
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
Expresiòn de proteínas humanas o de mamíferos en bacterias:

 Las células bacterianas son extremadamente útiles para la traducción activa de

proteínas de mamíferos, immunológicamente activas.

 La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita resolver los problemas

siguientes:

1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones post-

tranduccionales.
2. Los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas
bacterianas.
3. Los genes eucariotas contienen intrones.
4. Los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas
bacterianos.
5. Llas proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias forman cuerpos de
inclusión insolubles
6. Ls proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por las
proteasas de la bacteria y ser degradadas.
EL CASO DE LA INSULINA HUMANA
lacZ
Amp
R

ADN foráneo
TRANSFECCION: Transitoria y Estable
 Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el plásmido no ha
sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos.

 Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a

uno ó más cromosomas eucariotas.

Co-transfeccion
Es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la co-
transfección se puede verificar si la transfección se ha realizado
correctamente. Para lograrlo se co-transfecta un plásmido cuya presencia
es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido
de interés ha sido bien transfectado.
Métodos de Transfección:
GENES REPORTEROS O MARCADORES
 FAGOS

¿ Qué son los virus ?

Estructura de los fagos:

FAGOS ICOSAEDRICOS

FAGOS
HELICOIDALES
Clasificación de los fagos:

• El genoma de los fagos puede ser:

- RNA simple cadena (MS2, Qß),

- RNA doble cadena (phi 6),
- DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o
- DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2,
T4).

• Los fagos pueden ser:

-líticos,
-temperados o lisogénicos
Ciclo lítico y lisogénico
 Los fagos pueden generar el ciclo lítico o el ciclo lisogénico, aunque muy
pocos son capaces de llevar a cabo ambos. Si se lleva a cabo la lisis, no
puede llevarse a cabo la lisogenia y viceversa.

 En el ciclo lítico, las células hospedadoras del fago son lisadas (destruidas)
tras la replicación y encapsulación de las partículas virales, de forma que los
nuevos virus quedan libres para llevar a cabo una nueva infección.

 Por el contrario, en el ciclo lisogénico no se produce la lisis inmediata de la

célula. El genoma del fago puede integrase en el ADN cromosómico de la
bacteria hospedadora, replicándose a la vez que lo hace la bacteria o bien
puede mantenerse estable en forma de plásmido, replicándose de forma
independiente a la replicación bacteriana. En cualquier caso, el genoma del
fago se transmitirá a toda la progenie de la bacteria originalmente infectada. El
fago queda así en estado de latencia hasta que las condiciones del medio se
vean deterioradas: disminución de nutrientes, aumento de agentes
mutagénicos, etc. En este momento, los fagos endógenos o profagos se
activan y dan lugar al ciclo lítico que termina con la lisis celular.
CICLO
LITICO

VS.

CICLO
LISOGÉNICO
 PLÁSMIDO

FAGOS
CÓSMIDOS
BAC:
Bacterial Artificial Chromosome
CREACIÓN DE UN BANCO O BIBLIOTECA DE DNA
Longitud máxima aproximada de ADN que puede clonarse en vectores
Ejemplo:
 SONDAS NUCLEICAS Y SONDAS MOLECULARES

Sondas nucleicas
• Desnaturalización

- Complementariedad de las bases

• Hibridación
Hibridación molecular
La Tm = Temperatura de disociación

Desnaturalización:
- por calor
- por pH alcalino

Detección de sondas y anticuerpos:

- radiografía
- reacción enzimática
- luminiscencia
Diseño de sondas oligonucleicas sobre la
base de la secuencia proteica
Técnicas basadas en la hibridación molecular

- Dot-blot

- Colony-blot

- Southern-blot

- Northern-blot

- Hibridación in situ

- Western-blot

- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

- Rección en cadena de la polimerasa (PCR)

Dot-blot
Colony-blot
SOUTHERN BLOT
(Edwin Southern)
Permite detectar la presencia de una
secuencia de ADN en una mezcla
compleja de este ácido nucleico.

Emplea la técnica de electroforesis en gel

de agarosa con el fin de separar en base
a la longitud de los fragmentos de ADN y,
después, una transferencia a una
membrana en la cual se efectúa la
hibridación de la sonda.
 SOUTHERN BLOT
* Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena)
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Detectar la presencia de un gen, DNA-fingerprints, etc.
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA 32P
moléculas de DNA
de DNA …TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
4. Revelado

DNA
interés
32P e-

Todos los DNA

DNA de interés
Southern-blot
 Northern blot
Técnica de detección de moléculas de ARN de una
secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Por
ejemplo: un ARN mensajero para un péptido dado en una
extracción de ARN total.

Se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis

en gel a fin de separar los fragmentos. Luego, se transfiere
el contenido del gel, a una membrana cargada
positivamente en la cual se efectúa la hibridación de una
sonda molecular marcada radiactiva o químicamente
NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA 32P
moléculas de RNA
de RNA …TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado

RNA
interés
32P e-

Todos los RNA

RNA de interés
Nothern-blot
 Western blot
 Método en biología molecular / bioquímica /
inmunogenética para la detección de proteínas en una
muestra de un tejido homogeneizado o extracto.

 Implementa gel electroforesis para separar proteínas

desnaturalizadas de la masa.

 Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la

membrana (originalmente de nitrocelulosa), donde son
examinadas utilizando anticuerpos específicos para la
proteína. Como resultado, los investigadores pueden
examinar la cantidad de proteínas en una muestra y
comparar los niveles de presencia entre varios grupos.
Western-blot
 Detección de ADN de WSSV en tejidos
Hibridación in situ de P. Monodon por hibridación in situ

Controles
negativos

A:integumento
B: estómago
C: intestino
D: branquias
E: ojo
F: corazón

Controles
positivos

G: estómago
PCR positivo
H: integumento
PCR positivo
I: falso positivo
con hibridación
sin sonda
 Detección de ADN de WSSV en tejidos positivos por PCR de P. monodon por
hibridación in situ.

A,B: branquias
C,D: intestino
E,F: corazón
G,H: órgano linfoide
I,J: cordón nervioso ventral
K,L: hepatopáncreas
ELISA (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
(Polimerasa Chain Reaction)
 Fue diseñada por el Dr. Kary
Mullis en 1987.

 Ganó el premio Nóbel de

Química en 1993 por su
invento.

 Utilizo el PCR para

amplificación del gen de -
hemoglobina humana, y el
diagnostico prenatal de anemia
falciforme.
La PCR es una técnica para copiar DNA
A diferencia del proceso de replicación, la
PCR copia fragmentos específicos de DNA.
La PCR permite obtener millones de
copias a partir de un fragmento de DNA.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
(Polymerase Chain Reaction)

Es la amplificación de DNA in vitro

por medio de la polimerización en
cadena de DNA utilizando un
termociclador.

El propósito del PCR es hacer

muchas copias de un fragmento de
DNA.

Se realiza la amplificación de un

segmento específico de DNA,
teniendo poco material disponible.
 Termociclador

 La PCR se realiza en
un “Thermo Cycler”
Termociclador.

 Es una máquina que

calienta y enfría la
reacción en periodos
cortos de tiempo.
APLICACIONES DE LA PCR

 Diagnóstico precoz de enfermedades

genéticas
 Detección de enfermedades víricas
 Medicina forense y criminología
 Estudios evolutivos y Arqueología
molecular
 Análisis de alimentos
– Detección de patógenos
– Identificación de especies
– Detección de transgénicos
 El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos
que se repiten 25 veces o más:

1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra

de DNA y convertirla en hebra sencilla.
Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por
15 a 40 segundos, el tiempo depende del tamaño del
genoma.
2. Apareamiento o “anneling”:

• Los cebadores “primers” previamente diseñados,

reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en
lugares específicos por complementariedad de bases.
Para esto, se baja la temperatura, ej: 55˚C por 30
segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar
entre cebadores según sea el caso.
3. Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el

espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el
DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea

necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sean necesarios.

Etapas del ciclo de PCR

1. Desnaturalización (94ºC): separación de las hebras de

DNA
2. Hibridación de los primers (50-60ºC) a cada hebra por
complementariedad
3. Elongación (72ºC): síntesis de DNA (adición de
nucleótidos, DNA polimerasa)
Cada nuevo fragmento
sintetizado actúa como molde
(2 copias) para el siguiente ciclo de
reacción

Tras n ciclos obtenemos 2n

copias del fragmento

30 ciclos
(4 copias)
1.073.741.824 copias

(23 copias)
Termociclador  Repetir ciclos (unos 30) de:

1. Desnaturalización  94 ºC
2. Annealing  50-60 ºC
3. Elongación  72 ºC
En la PCR hay una amplificación exponencial
REQUERIMIENTOS ESENCIALES:

1. Dos cebadores o primers sintéticos (20 nucleótidos),

portan el 3’ OH

2. DNA blanco.

3. DNA polimerasa termoestable

4. Los 4 dNTP

5. Buffer

6. MgCl2

7. OTROS: Glicerol, DMSO, BSA, Formamida, TAQ Extender,

etc.
1. Selección de los cebadores

Especificidad- (tamaño)
Eficiencia de la amplificación.

Secuencia de los cebadores: Evitar formación de

estructuras secundarias (auto-complementarias), no
homología significante con otro lugar de la cadena
molde. Dímeros de primers (extremo 3’ secuencias
NNGC O NNCG)

Composición de bases: Contenido de G + C: 40 al 60

%, distribución de las 4 bases igual.

Longitud de los primers: región complementaria 18-

25 bp (diferencia no > a 3 pb)
Tm : oligos y secueencia blanco: Varias formulas
15-20 pb: Tm (C) = 2 (A+T) + 4 (G+C)
 pares de oligos: no > 5 C
 Primers y el producto no > 10 C.

Concentraciones: 0.1-1.0 M de c/oligo, 30 ciclos:

fragmento 1 kb
Conc: errores de apareamiento: amplificación inespecífica

Adición de sitios de restricción: extremo 5´del primer

2. DNA Molde

Molde: cadena sencilla o doble, circulares o lineales

DNA: > 10 kb enzimas de restricción

Pureza: Contaminantes pueden disminuir eficiencia de la

PCR: Urea, SDS, Acetato de Sodio y agarosa....

Cantidad:
 DNA genómico mamíferos: 1.0 g de DNA
 Levaduras: 10 ng
 Bacterias: 1 ng, Plasmidos 1 pg

Mucha cantidad de DNA: eficiencia.

3. DNA Polimerasa

Variedad de enzimas : Fidelidad, eficiencia y habilidad Taq

polimerasa : enzima de elección (0.5- 2.5 unidades : 25 l de Rx)

DNA polimerasa termoestable: Eubacteria termófila e

hipertermofilica: Archaebacteria, T. aquaticus: Taq polimerasa.

Variaciones: manufactura
Alta eficiencia: Función correctora
Clonar: extremos romos
Mezcla de enzimas: DyNazyme (Tbr + taq)
Taq plus (taq + Pfu)
4. dNTPs
Concentración de dNTPs:
Cantidad equimolar: 200-250 M de c/ dNTP.
> [] 4mM: inhiben la reacción: Mg2+

Manufactura: libres de pirofosfato, Inhiben la PCR

NaOH pH 8.1: Protegen de daño
congelación

5- Cationes divalentes (Mg2+):

Actividad de la DNA polimerasa
Cationes calcio: inefectivos
dNTPs, se unen al Mg2+  [ ] > P
[ ]: 1.5 mM ( 4.5-6mM:  inespecificidades)
Optimización con cada PCR :  [ ] Mg: 0.5-5mM
6. Buffer:
Mantiene el pH: Tris – CL. pH: 8.3- 8.8 T ambiente: 10mM:
72C: pH 7.2
Cationes Monovalentes: 50 mM KCl: DNA > 500pb

7. Otros componentes.
PMPE: Incrementa el producto y reduce el background en
muchos casos

DMSO y Glicerol: Pueden ayudar en DNA con alto

contenido en GC

Taq extender: Para generar productos de varios kb

(hasta 10 Kb)
 Componentes de la PCR
Cocktail
Componentes Concent. Final Por reacción
I II III IV

10X PCR buffer 1X 10  l 40 40 40 40

Primer 1 0.5  M 1l 4 4 4 4

Primer 2 0.5  M 1l 4 4 4 4

DNA molde No diluido 1l 40 40 40 40

4 dNTP 25 mM 0.2 mM 0.8  l 3.2 3.2 3.2 3.2
Taq Pol 2.5 U 0.5  l 2 2 2 2

MgCl2 1.5 mM 8l 32 32 32 32

DMSO 5% 5l --- 20 --- ---

Glicerol 10 % 10  l --- --- 40 ---

PMPE 1% 1l --- --- --- 4

Agua --- Hasta 90  l 266.8 246.8 266.8 262.8

El estudio y uso de los productos de PCR

• Análisis por electroforesis en gel

• Clonaje

• Secuenciación

• Detección por southern blotting

 Análisis por electroforesis en gel
• Para la visualización de los productos de PCR (los fragmentos
amplificados) se realiza una electroforesis en gel, que consiste:

•5-8ml de cada reacción de PCR se cargan en un

gel de agarosa o poliacrilamida.

•El gel es sometido a una corriente

eléctrica contínua (100V aprox) que obliga
al ADN a migrar a través del gel (hacia el
polo +). El gel es una matriz porosa, que
permite la separación de los fragmentos de
ADN según su tamaño.

•Tinción del gel con bromuro de etidio y

visualización bajo luz UV.
Análisis por electroforesis en gel

• Este análisis permite:

 Determinar el tamaño exacto del fragmento. Si hay

mutaciones que alargan o acortan el gen, se pueden
detectar.

 Realizar análisis de restricción del fragmento,

determinando si hay modificaciones o diferencias con
respecto a secuencias de “referencia”. Esta técnica
se emplea en el diagnóstico y forénsica.

 La presencia o ausencia de fragmentos puede

indicar si un gen está o no está en una genoteca.
Clonaje

• En muchos casos, el producto se insertará en un

vector para el análisis funcional del fragmento.

• En general, Taq suele dejar una adenina extra en el

extremo 3’. Esto plantea problemas para la inserción
del fragmento.

• Normalmente, los primers se diseñan con sitios de

restricción deseados en el extremo 5’(cola), que no
hibridan en el primer ciclo, pero que luego se
incorporan a los fragmentos copiados en los ciclos
siguientes.
Secuenciación

• El objetivo mas común tras la obtención de un

fragmento de PCR es su secuenciación.

• Hoy en día, el DNA es secuenciado de manera

automatizada, y el resultado se remite en soporte
digital, el cual puede incorporarse a aplicaciones
boinformáticas adecuadas para el análisis de
fragmentos.
Southern Blotting

• Es una técnica por la que el producto de una PCR

puede usarse para determinar si existen secuencias
similares en otras muestras.

• Es una técnica muy importante en el análisis de

DNA.
 TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
 RT-PCR : detección de mRNA
 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de
otra previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma
simultánea
 In situ PCR: detección en tejido mismo, ubicación del
fragmento
 C-PCR : inmunocaptura previa a PCR
 PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que
RAPDs)
 Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en
tiempo real
Multiplex PCR

 Describe una PCR enla cual hay presentes multiples

pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de
productos. Los mismos pueden verse como múltiples
bandas en un gel de agarosa

 Multiplex PCR es frecuentemente usada en

diagnóstico médico

 Ahorra templado, tiempo y gastos

 Requiere una cuidadosa optimización

 Nested PCR

 A veces 1 ronda de PCR no da un producto único product

a partir de un templado complejo, apareciendo un
“chorreado”

 Se puede resolver utilizando un segundo par de primers

que hibriden un poco mas internamente que los primeros

 Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto

de la primera (chorreado)

 Rinde un producto único, porque solo el fragmento

correcto de ADN posee los sitios correctos de
hibridización para el segundo par de primers
Nested PCR

1era PCR

Chorreado de ADN

2da PCR

ADN específico
RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa

 Para amplificar copias de cDNA de RNA

 Es especialmente útil cuando solo se dispone de
pequeñas cantidades de RNA
 Frecuentemente usada para amplificar genes específicos
(como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida
 Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa
dependendinte de RNA
 Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA
 Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN
 Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el
duplex de cDNA por PCR
 RT-PCR

mRNA AAAAAAAAAA-3’ Primer Antisense:

(sense) TTTTTTTTTT-5’ oligo(dT)o

Transcripción reversa

GSP1 (sense)
AAAAAAAAAA-3’
TTTTTTTTTT-5’
1ra cadena cDNA
GSP (antisense)

PCR usando
GSP+GSP1
GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

RAPD of P. aeruginosa
 REAL TIME PCR

INTRODUCCION
- PCR (estandar)
- RT-PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de
reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones
Cuantificación de copias de mRNA

1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de

drogas por ejemplo)

2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos

procedimientos:

 células obtenidas por LCM (laser capture

microdissection)
 cantidades pequeñas de tejidos
 células primarias
 Cuantificación del número de copias de DNA
presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de
carga viral, comparación entre número de copias en
diferentes subespecies, etc.)

 Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real

(análisis de la expresión de genes en diferentes
tejidos o en diferentes condiciones normales vs
patológicas, efecto de drogas, etc)

 Análisis de la cinética de la reacción

Detección y cuantificación de reporteros
fluorescentes.

La fluorescencia emitida es proporcional a la

cantidad de producto formado en cada ciclo de
PCR.

Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons

moleculares, SYBR Green
Ventajas del PCR en tiempo real

 Simple y rápida (semi-automatizada).

 No hay manipulación post-PCR.
 Eliminación de contaminación por amplicones.
 Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
 Muy sensible.
 Detección de productos inespecíficos con la opción
“curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
 Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.
 Extraordinariamente específico.
Marcadores Moleculares
Marcadores Moleculares
Microsatelites
Marcadores Moleculares
AP PCR-RAPD
Marcadores Moleculares
Técnicas del ADNr:

SISTEMAS DE
TRANSFERENCIA
GENÉTICA
Acelerador de Partículas
(Gene Gun):

Un cañón artificial
bombardea
micropartículas con el
inserto, sobre la célula.
Electroporación:

Uso de carga eléctrica

para que el ADN
atraviese la membrana
nuclear.
Polietilenglicol

Exposición de las membranas al PEG, facilita el

movimiento de las moléculas de ADN.
 Liposomas

Los vectores pueden

ser encapsulados en
pequeñas vesículas
de membrana para
introducir el ADN in
vivo en la célula.
 Microinyección

Una célula es adherida a una

pipeta bajo un microscopio y el
ADN foráneo es inyectado
directamente en el núcleo usando
una micropipeta muy fina. Se usa
cuando hay pocas células
disponibles, tales como células
fertilizadas de huevo animal.
Agrobacterium

Uso de la bacteria como "Ingeniero Genético". La bacteria

conteniendo el inserto, infecta las células de la planta
produciendo la recombinación genética.

Silicon Wiskers

Inyección con fibras microscópicas, que atraviesan las

membranas con los insertos.
 UNIDAD IV

PRINCIPIOS DE FERMENTACIÓN
INTRODUCCION

Fermentación
Por qué fermentamos ?

 Preservación de los alimentos

 Inhibición de patógenos

 Inhibición de organismos indeseados

 Cambio de las características organolépticas

 Flavor

 Textura

 Aroma

 $$$
Importancia de la Fermentación.

 Procesos de fermentación en alimentos:

 Naturales o espontáneas (fermentación del cacao,

ensilado, pozol).

 Inoculadas ( vino, yogurt, tempeh).

 Procesos de fermentación en medios de cultivo:

 Producción de biomasa (proteína unicelular, levadura

de pan, levadura de cerveza).

 Obtención de metabolitos primarios ( alcohol, ácidos

orgánicos) y secundarios ( enzimas, polisacáridos).
Principios de los procesos de fermentación de alimentos
4.1 DEFINICIÓN Y CONCEPTO DE FERMENTACIÓN

moléculas
Fermentación
 La fermentación es un proceso de tipo catabólico, de transformación
de complejas, en moléculas simples, dentro del
metabolismo.

 La fermentación es un proceso catabólico de oxidación que requiere

de condiciones anaeróbicas, para obtener como producto final un
compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan
los diversos tipos de fermentaciones.

 Proceso metabólico en el que los carbohidratos y compuestos afines

son oxidados con liberación de energía, en ausencia de cualquier
aceptor de electrones de procedencia externa (sin O2).
Ejemplo
 Fermentación etílica:

 Se transforman los azúcares de las uva en etanol, debido a la

acción de las levaduras.
Ejemplo

 Fermentación láctica:
FERMENTACIÓN

 Ruptura
Fermentación
Fermentación
anaeróbica de un sustrato orgánico por un
sistema enzimático en el que el aceptor final de electrones
es un compuesto orgánico

 Proceso biológico que ocurre en la oscuridad y que no

involucra cadenas respiratorias con oxígeno o nitrato
como aceptor de electrones
 Proceso de fermentación

MICROORGANISMOS
Bacterias, levaduras , hongos MICROORGANISMO

SUSTRATOS Y MEDIOS
DE CULTIVO CO2

CONDICIONES AMBIENTALES PRODUCTO

(BIOREACTORES) Intra o extra celular
Fermentación y Respiración celular

 Las células llevan a cabo procesos para funcionar

normalmente, los cuales requieren energía.

 Respiración celular- serie de reacciones mediante las

cuales la célula degrada moléculas orgánicas y produce
energía.

 Todas las células vivas llevan a cabo respiración celular

para obtener la energía necesaria para sus funciones.

 Usualmente se usa glucosa como materia prima, la cual

se metaboliza a bióxido de carbono y agua, produciéndose
energía que se almacena como ATP (adenosin trifosfato).
 C6H12O6 + O2 CO2 + H2O + ATP
glucosa oxígeno bióxido agua energía
de carbono

 ATP- formada por adenina, ribosa y tres grupos fosfatos con

enlaces ricos en energía.

 Cuando la molécula se hidroliza, el fosfato terminal se separa

para formar ADP (difosfato de adenosina) y se libera energía.

 El ATP es la fuente de energía que se usa como combustible

para llevar a cabo el metabolismo celular.
 La respiración celular se divide en pasos y sigue distintas
rutas en presencia o ausencia de oxígeno:

 Respiración aeróbica- en presencia de oxígeno.

 Respiración anaeróbica- en ausencia de oxígeno.

 Ambos procesos comienzan con la glucólisis.

Glucólisis

 Es el primer paso de la respiración celular y consiste en una

serie de reacciones que ocurren en el citoplasma de la
célula y por las cuales, a partir de una molécula de glucosa,
se producen dos moléculas de ácido pirúvico (piruvato).

 Todos los organismos llevan a cabo la glucólisis. La

glucólisis se divide en dos partes:

 en la primera la molécula de glucosa se divide en dos

moléculas de gliceraldehido-3-fosfato; y,
 en la segunda estas dos moléculas se convierten en dos
moléculas de ácido pirúvico (piruvato).

 Durante la glucólisis se producen dos moléculas de ATP.

 GLUCOLISIS
FASE I 1

2
ENZIMAS:
1. Hexoquinasa
2. Glucosa fosfato
3
isomerasa
3. Fosfofructoquinasa
4. Aldolasa
4
5. Triosa fosfato
isomerasa
5
 GLICOLISIS
FASE II 6

ENZIMAS:
6. Gliceraldehido 3 fosfato 8
deshidrogenasa
7. 3 fosfoglicerato quinasa
9
8. Mutasa
9. Enolasa
10. Piruvato quinasa
10

296
 FASES DE LA GLUCOLISIS

FASE I: BALANCE ATPs:

2ATP

G 2 G3P -2 ATP
C6 2 ADP 2 C3P

FASE II:
2 Pi 4 ADP

2 G3P 2P +4 ATP
2 C3P 2 C3
4 ATP

NETO : +2 ATP
glucosa + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ → 2 Ácidos pirúvicos + 2ATP + 2NADH + 2H+

 En ausencia de oxígeno, luego de la glucólisis se lleva a

cabo fermentación (respiración celular anaeróbica).

 Algunas bacterias sólo llevan a cabo fermentación,

mientras que la gran mayoría de los organismos
(incluidos los humanos) pueden llevar a cabo respiración
celular aeróbica y anaeróbica.
Respiración celular aeróbica

 Conjunto de reacciones en las cuales el ácido pirúvico producido

por la glucólisis se transforma en CO2 y H2O, y en el proceso, se
producen 36 moléculas de ATP.

 En las células eucariotas este proceso ocurre en la mitocondria en

dos etapas llamadas el Ciclo de Krebs (o ciclo de ácido cítrico) y
la cadena de transporte de electrones.
Cadena de transporte de electrones

 Los electrones producidos en glucólisis y en el ciclo de

Krebs pasan a niveles más bajos de energía y se libera
energía para formar ATP.

 Durante este transporte de electrones las moléculas

transportadoras se oxidan y se reducen.

 El último aceptador de electrones de la cadena es el

oxígeno.

 En la cadena se producen 34 moléculas de ATP a

partir de una molécula inicial de glucosa.
Respiración celular anaeróbica

 Respiración celular anaeróbica- ocurre en ausencia de

oxígeno.

 Este mecanismo no es tan eficiente como la respiración

aeróbica, ya que sólo produce 2 moléculas de ATP, pero
al menos permite obtener alguna energía a partir del
piruvato que se produjo en la glucólisis.

 Hay dos tipos de respiración celular anaeróbica:

fermentación láctica y fermentación alcohólica.
 RESUMEN. Producción de ATP

• En la respiración
celular aeróbica se
producen 36 moléculas
de ATP a partir de una
molécula de glucosa,
mientras que en la ruta
anaeróbica sólo se
extraen 2 moléculas de
ATP a partir de una
molécula de glucosa.
4.2 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

SUSTRATOS PARA PROCESOS DE FERMENTACION.

Se debe considerar costos, disponibilidad y estabilidad en

su composición química. Los sustratos son las fuentes
principales de C y N.

Deben tener una aproximación a la composición de la

biomasa del microorganismo. Una composición elemental
en peso seco es:

- Carbono: 46 – 48%
- Nitrógeno: 7-12
- Fósforo: 1–3
- Azufre: 0.5 – 1
- Mg: 0.5 – 1
Requerimientos generales de sustratos y medios
de cultivo

 Que contengan los componentes necesarios para lograr el

crecimiento y formación de productos en el proceso.
 Conocer los proceso y operaciones previos y conocer los
mecanismos bioquímicos que regulan la formación de
productos.
 Requerimientos Nutricionales: fuentes de nitrógeno,
micronutrientes, macronutrientes.
 Tipo de metabolismo celular:
 Autótrofos
 Heterótrofos
 Condiciones de Cultivo:
 Aerobio: oxigeno como aceptor de electrones
 Anaerobio: N, SO4, NO3 como aceptor de electrones.
 Factores de crecimiento:

 Aminoácidos, tiamina, riboflavina, niacina; la mayoría

son constituyentes de coenzimas.

 Disponibilidad de los Componentes:

 Componentes susceptibles de ser usados por la

célula.
 Concentración de iones metálicos modificada por
quelación, para controlar el fenómenos se usa agentes
quelantes, EDTA.
 Se debe tener en cuenta la naturaleza de los
compuestos orgánicos que pueden actuar como
ligandos y sobre todo del ion metálico considerado, es
necesario controlar su concentración.
SUSTRATOS Y MEDIOS DE CULTIVO.

Medios de cultivo:

 M. Sintéticos: químicamente definidos.

 M. Complejos: Origen animal o vegetal como peptonas,
extracto de levadura, macerado de maíz, extracto de soja.
Químicamente indefinidos y de composición variable.

Sustratos:

 Macronutrientes: Fuentes de C, N, S, P, K y Mg, en g/l.

 Micronutrientes: Elementos traza. Sales de Fe, Mn, Ca,
Zn, Co, en mg/l.
 Factores de Crecimiento: vitaminas, aminoácidos, ácidos
grasos, etc.
Tipos de medios de cultivo.

Por su consistencia:

 Sólidos: Contienen agente gelificante (agar). Petri o Slant

 Líquidos: Caldos. Se preparan en tubos y matraces.

Por su composición:

 Medios Generales: Desarrollo de gran variedad de MO.

 Medios de Enriquecimiento: Favorecen el desarrollo de
determinado grupo de MO.
 Medios Selectivos: Crecimiento de un tipo de MO e inhiben
el desarrollo de los demás.
 Medios Diferenciales: Énfasis en alguna propiedad que un
determinado MO posee.
Constituyentes de medios de cultivo:

 Agar: Ag solidificante. Polisacárido de algas marinas. Las

bacterias no lo degradan.
 Azúcares: Fuente de C, glucosa, lactosa, sacarosa.
 Extractos: Preparados de órganos o tejidos animales o
vegetales, extracto de carne, levadura.
 Peptonas: Proteínas hidrolizadas, obtenidas por digestión
química o enzimáticas de proteínas animales o vegetales.
 Fluidos: Sangre, plasma o suero. Se añaden a otros medios.
 Amortiguadores: Sales para mantener el pH en rangos
óptimos. Fosfatos de Na y K.
 Indicadores de pH: Indicadores acido-base añadidos para
detectar el cambio de pH.
 Agentes Reductores: Sustancias para crear condiciones
apropiadas. Cisteína, tioglicolato.
 Agentes Selectivos: A determinadas concentraciones
seleccionan microorganismos. Cristal violeta, sales biliares.
4.3 CLASIFICACIÓN DE LAS FERMENTACIONES

Fermentación
 Fermentación Controlada y Natural

 Fermentación natural

Crear condiciones para inhibir fermentaciones

indeseables y permitir las fermentaciones deseables

Ejemplos:
– fermentación
• Bebidas del tipo de la cerveza: Brussels,
Belgium
– Fermentaciones vegetales
Vegetales + sal
 Fermentación
 Fermentación controlada

– Agregado deliberado de microorganismos para

asegurar la fermentación

• Ejemplo: productos fermentados lácteos

– Lactosa ácido Láctico

– Cultivos Starter
 Lácticos o starter láctico o bacteria ácido
láctica (LAB)
 Fermentación Secundaria
Fermentación
 Microorganismos diferentes a los starters (flora
secundaria)

Ejemplo: productos fermentados lácteos

 bacterias no starters ácido lácticas (NSLAB)

 mejora de las propiedades organolépticas del

producto
4.4 FERMENTACIONES AGROINDUSTRIALES
Fermentación
Bioquímica de la fermentación

 Azúcares Ácidos Alcoholes, Aldehídos

 Proteínas Aminoácidos Alcoholes,

Aldehídos

 Lípidos Ácidos Grasos libres Cetonas

DEGRADACION DE LOS AZUCARES

 Los azucares son moléculas que al ser oxidadas

producen energía para la célula, esta oxidación se
lleva a cabo en 2 etapas:

a) Etapa citosólica a través del proceso de la

glicólisis anaeróbica, y

b) Etapa mitocondrial, a través del proceso de

respiración celular, la que se da en condiciones
aeróbicas.
Microorganismos Usados en Fermentaciones
Fermentación
 Bacterias productoras de ácido láctico
 LAB Homofermentativas
 LAB Heterofermentativas

 Levaduras productoras de etanol

 Saccharomyces cerevisiae

 Microorganismos productores de flavor

 Bacterias, levaduras, mohos

 Bacterias productoras de ácido acético

 Acetobacter
Fermentación láctica
Yogurt

Ácido pirúvico + NADH + H+ ácido láctico + NAD+

• Ocurre en algunas bacterias y gracias a este

proceso obtenemos productos de origen lácteo tales
como yogurt, crema agria y quesos.

• Este proceso sucede también en el músculo

esqueletal humano cuando hay deficiencia de
oxígeno, como por ejemplo, durante el ejercicio
fuerte y continuo.

• La acumulación del ácido láctico causa el dolor

característico cuando ejercitamos los músculos
excesivamente.
LAB Homofermentativas

• Glicólisis anaerobia de glucosa

Glucosa 2 Piruvato 2 Lactato

• Rendimiento 1.8 mol de lactato por mol de glucosa

(~90% conversión)

• Rendimiento neto de energía: 2 mol ATP/mol

glucosa

• Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus,

Lactobacillus (algunos)
LAB Heterofermentativas
• Ruta monofosfato o pentosafosfato

Glucosa ácido láctico(~50%) + Ethanol +CO2

También puede formar acetato

Rendimiento neto de energía: 1 mol ATP/mol glucosa

• Leuconostoc, Lactobacillus (algunos)

• Algunos Lactobacillus heterofermentativos

– Rutas bioquímicas alternativas para obtener energía

• fermentación de Arginina
• Fuerza motora de protones
Fermentación alcohólica

• Este tipo de fermentación ocurre en

levaduras, ciertos hongos y algunas Cerveza
bacterias, produciéndose CO2 y
alcohol etílico (etanol); ambos
productos se usan en la producción
de pan, cerveza y vino.
Vino

Ácido pirúvico acetaldehído + CO2

acetaldehído + NADH + H+ etanol + NAD+ Pan

Saccharomyces

• Saccharomyces
– saccharo: azúcar
– myces: hongo

• Se encuentra naturalmente en uvas y otros frutos

• Muchas cepas se encuentran disponibles

comercialmente

• Metabolismo Aeróbico o anaeróbico

• El alcohol es producido anaeróbicamente

Glucosa Etanol + CO2

Microorganismos Productores de Flavor

• Bacteria
– Limburger- Brevibacterium linens
– Swiss- Propionibacterium freundenreichii

• Hongos
– Camembert- Penicillium camemberti
– Roquefort- Penicillium roqueforti
– Temphe- Rhizopus oligosporus
 FERMENTACIONES EN ESTADO SÓLIDO O
SEMISÓLIDAS

• Fermentaciones de uno o mas sustrato con una cierta

humedad.

– Ej.: 10% humedad

90% sustrato

• Fermentaciones sumergidas utilizan 10-20% material

sólido, el resto es solución conteniendo nutrientes.

• Se puede realizar en bandejas o en columnas.

• Los microorganismos utilizados son fundamentalmente
hongos, en algunos casos pueden ser : levaduras y
bacterias, dependiendo de la humedad del sustrato

• Se desarrollaron inicialmente para mejorar la

conservación de alimentos.

 Para cambiar sus propiedades físicas

 Para eliminar factores antinutricionales

 Para mejorar digestibilidad

• Uso tradicional en oriente para producción de
alimentos:

 Tempeh, Miso, Koji

• Debido a la baja disponibilidad de agua, en estas

fermentaciones, no hay problemas de contaminación
con bacterias, a pesar de que el sustrato no se
esteriliza
• Nuevos Usos:

 Producción de enzimas:
 Amilasas, celulasas, hormonas.

• Producción de ácidos:

 cítrico, gálico

• Producción de micotoxinas

 aflatoxina
DESARROLLO DEL MICELIO EN CULTIVOS
SUMERGIDOS Y EN MEDIO SÓLIDO
FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO
CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DE UN
PROCESO DE FERMENTACIÓN EN ESTADO
SÓLIDO.

• Contenido de humedad:

aw : 0.86 - 0.90

• aw = p. vapor solutos/p. vapor solvente

• Debe ser determinada en cada caso

aw  bacterias  0.9 
hongos  0.7 
• Temperatura

• Ajustar pH (M.O)

• Hacer un pretratamiento al sustrato (poroso)

debe quedar con una estructura granulosa.

• Agregar nutrientes (N, P)

• Inocular con alta concentración de esporas

COMPARACIÓN ENTRE TIPOS DE FERMENTACIÓN

F. sumergida F.s. sólida

• Conocimiento numeroso escaso

fisiológico

• Conocimiento bastante suficiente

tecnológico

• Mantención cond. fácil difícil

óptimas

• Control de parám fácil difícil

 COMPARACIÓN ENTRE TIPOS DE FERMENTACIÓN

F. sumergida F.s. sólida

• Vol. de equipos elevado reducido

• Gasto de energía elevado reducido

• Inversión elevada reducida

• Productividad alta alta

• Rendimiento alto bajo
 VENTAJAS DE LAS F. SEMISÓLIDAS

• Con ayuda de tecnología se puede hacer a muy

pequeña escala.

• No se producen residuos al final de la fermentación;

en tempeh 25% de azucares  proteína.

• Los requerimientos de agua son muy bajos y el

producto se puede secar mas para estabilizarlo

• Aunque se produce contaminación esta es propia de

los laboratorios, es limitada su extensión y fácilmente
detectable.
• En general los productos no requieren un tratamiento
posterior.

• No requiere concentración, mas bien dilución.

• Sólido aglomerado

• Se produce una expresión diferencial de ciertos

metabolitos que no se expresan en medios líquidos.

• Volumen limitado de efluentes

 ALIMENTOS FERMENTADOS ORIENTALES:
SALSA DE SOYA O SHOYU

• Original de china, tendría miles de años

• Se prepara a partir de porotos de soya, los que
se remojan y se hierven.
• Se enfrían y mezclan con trigo tostado, lo que
entrega nutrientes para el desarrollo del hongo.
• Se inocula inicialmente con Aspergillus oryzae el
que convierte:
• Almidón  Azúcares fermentables (glucosa)
• El puré de azucares fermentables se deja fermentar
por 6-12 meses con una mezcla de bacterias del ác.
Láctico y levaduras.

• Cuando los porotos se encuentran completamente

colonizados con el hongo, se agrega salmuera 
20%

• Se producen enzimas que hidrolizan: proteínas,

grasas, etc. y producen una solución que contiene el
sabor típico de la carne y se denomina Salsa de
Soya.

• Se consume con arroz cocido generando un buen

alimento.
 TEMPEH

• Alimento original de Indonesia.

• El tempeh es una pasta de granos de soja
fermentados que se hace inoculando un tipo de
hongo llamado Rhizopus oligosporous a los porotos
de soya cocidos.
• Este hongo forma un micelio que mantiene unidos
los granos de soya y es responsable de esas
manchas negras que se ven en el tempeh.
• Tiene una textura ‘correosa’ y un sabor muy peculiar.
Puede sustituir a la carne en recetas que lo
requieran. Se puede freir, preparar al horno o al
vapor.
• El tempeh contiene vitamina *B12 la que se encuentra
normalmente en carnes y otros alimentos de origen
animal

• * Cianocobalamina, su deficiencia produce anemia.

Requerimientos: 1- 1.5 mg/al día
• Preparación de tempeh

 Poroto soya se remoja por dos horas en agua

 se cuecen por 30 minutos
 se escurren y enfrían
 se inoculan con Rhizopus oligosporus
 se colocan sobre bandejas
 se incuban a 30ºc 8por 20-24 hrs.)
 se obtiene tempe (se fríe para comer)
 PRODUCCIÓN DE UN FORRAJE ENRIQUECIDO EN
PROTEÍNA

• Proceso para la producción de un forraje enriquecido en

proteína a partir de la fermentación en estado sólido de
la caña de azúcar que comprende:

 Corte y molienda de la caña de azúcar, inoculación

del sustrato y fermentación caracterizado porque se
logra un proceso no estéril donde se muele

 Hasta un tamaño de partículas comprendido en un

diámetro equivalente entre 0,3 - 5 mm.
• Se inocula con un nivel de inóculo que oscila entre
l07- l08 esporas/g de caña y la fase de fermentación
se desarrolla con una humedad que oscila entre 50-
80%.

• La aireación de l-l0 l de aire /kg de caña a pH entre

3,5 - 6,0

• Temperatura entre 30 - 55ºC que se logra mediante la

remoción de calor con la Humedad de aire entre l0-
80% de saturación.
FORRAJE ENRIQUECIDO EN PROTEÍNA

• Se obtuvo un producto final con las siguientes

características:

 Peso Final: l30 Kg.

 % de Humedad Final: 79%

 % de Proteína bruta en el producto final: 8% (b.s.)

 Por este proceso se logró incrementar el contenido de

proteína 4 veces.
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERÉLICO

• Acido giberélico es una hormona vegetal que permite

aumentar la maduración de la uva de mesa.

• Se puede producir a partir del cultivo en estado sólido del

hongo Gibberella fujikuroi.

• Utilizando nutrientes, sales, urea, y algún sustrato de

bajo precio, se hace crecer en amberlita, con una aw de
0.985en columnas de vidrio.

• Se obtuvo un desarrollo de biomasa de 40mg/g de

soporte y una producción de ácido giberélico de 0.73 mg/
g soporte.