Métodos de Análisis Agroindustrial.

Cromatografía.
CROMATOGRAFÍA
Desarrollada por Mikhail Tswett, en 1906 con el
fin de separar los colorantes que componen a las
plantas.
 DEFINICIÓN
• Métodos de separación eminentemente
físicos.
La cromatografía es una técnica que
permite separar los diferentes
componentes de una mezcla compleja,
para su identificación t/o cuantificación

La separación se logra por diferencias

en la movilidad relativa de los solutos,
lo cual se logra por las distintas
interacciones físicas y químicas entre
los componentes de la cromatografía.
 Componentes básicos de una
cromatografía

 Fase estacionaria
 Fase móvil
 Soluto o muestra
 Clasificación

Se aplican varios criterios

 De acuerdo a sus fases

 De acuerdo al soporte

 Al tipo de equilibrio que se establece en

la separación

 Al estado de agregación de la fase móvil

 Capa fina
Fase móvil Adsorción
líquida clásica
Intercambio
Fase iónico
estacionaria
sólida
Fase móvil
Gas-sólido
gas
Tipos
de
fases Partición
clásica
Fase móvil
líquida
Fase papel
estacionaria
líquida
Fase móvil
Gas Gas-líquido
 Según el soporte

Cromatografías Planas

Ventajas
• Sencillas
• Rápidas
• Bajo costo
Desventajas
• Solo con fines analíticos
• Poca eficiencia en la separación
• No se adapta a sistemas automatizados
Eluyentes más comunes para cromatografía en capa
fina.
• éter de petróleo • -iso-propanol
• -tolueno • -etanol
• -dietil-éter, t-butil-éter • -metanol
• -diclorometano • -ácido acético
• -acetato de etilo
• -n-pentano, n-hexano
• -ciclohexano
• -tetracloruro de carbono
• -éter dietílico
• -cloroformo
• -acetona
 REVELADORES MÁS COMUNES PARA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

 Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente

visibles; las incoloras pueden revelarse mediante:
• Luz UV
• La introducción de la placa en vapores de yodo.
• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un
compartimiento especialmente protegido y bajo una campana
de extracción de gases).
• Después calentar
Para la selección del adsorbente se debe
tomar las siguientes consideraciones:

a) Polaridad
b) Tamaño de partícula
a. Diámetro
b. Área Superficial
c) Homogeneidad
 FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA.

a) Temperatura
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes
de aire.
c) Limpieza de las placas.
d) Pureza de los disolventes
 ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
•

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las

separaciones)
b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó
básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
 Según el soporte

Cromatografías en columna
Ventajas
• Mas versátiles
• Se adaptan a sistemas automatizados
• Mayor resolución
• Mayor capacidad de carga
• Posibilidad de escalado a nivel productivo
Desventajas

• Necesidad de equipamiento
• Alto costo inicial
• Requiere personal capacitado
 Según el tipo de equilibrio

Método especifico Fase estacionaria Tipo de equilibrio

Líquido – líquido Líquido adsorbido Distribución entre

sobre un sólido líquidos inmiscibles
Líquido - sólido Sólido Adsorción

Resinas de Intercambio iónico

Intercambio iónico
Gel Exclusión

Sólidos/gel Afinidad
Clasificación según equilibrio

• Cromatografía de intercambio iónico:

Los iones del soluto son retenidos por los grupos funcionales
que se encuentran en la fase estacionaria.

• Cromatografía de exclusión molecular:

No hay equilibrio de separación . Se separan por el tamaño

partículas.
Clasificación según equilibrio
• Cromatografía de reparto: El soluto está en equilibrio entre el
líquido de la fase móvil y el de la fase estacionaria por
diferencias de solubilidades.

• Cromatografía de adsorción: Fenómeno superficial en el cual

las partículas del soluto son adsorbidas por la fase
estacionaria.
• Cromatografía de afinidad:
Reacción inmunológica donde el soluto es el antígeno y los
anticuerpos se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria.
 Factores que afectan la eficiencia de la
cromatografía

Difusión

Tamaño de partícula de la fase estacionaria

Sobrecarga del sistema

Uniformidad del sistema

PARAMETROS A CONSIDERAR EN
CROMATOGRAFIA
 Algunos conceptos previos
CROMATOGRAMA

Tiempo de retención= tiempo que transcurre desde la inyección de la

muestra hasta que el soluto alcanza el detector( a veces esta magnitud
se mide en volumen de elución)

Tiempo muerto= es el tiempo necesario Ancho del pico en la base= es el

para que una especie que no se retiene en la tiempo transcurrido desde que el
fase estacionaria alcance el detector soluto alcanza el detector hasta que
lo abandona
 Algunos conceptos previos

Factor de retraso (Rf)= factor que se obtiene experimentalmente y me

permite establecer la distancia recorrida por un soluto en relación a la
fase móvil. Aplica en las cromatografías PLANAS

Rf =
Constante de distribución(Kc)= Valor teórico que relaciona la
concentración de un soluto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.

Kc = Concentración molar del

analito en la fase
estacionaria

Concentración
molar del analito en
la fase móvil
Factor de retención (k) = factor que se puede determinar
experimentalmente y permite comparar la velocidad de migración de los
diferentes solutos.

K=

IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenido

k entre 1 y 5 valor ideal
k 20 o mayor cromatografías muy largas
Factor de selectividad (α)= relaciona los tiempos de retención de
dos solutos y por lo tanto me permite saber la eficacia de la
columna para separarlos.

α= = Valor siempre > 1

IMPORTANTE= ESTE FACTOR NO TOMA EN

CUENTA EL ANCHO DE PICO
Poder de separación de las columnas
Concepto de Plato Teórico (N)

Altura de la
Altura del plato (HEPT) H= L fase
N estacionaria
Fase móvil

El tipo y la composición de la fase móvil (eluyente) son variables

que influyen en la separación.
Las propiedades comunes a los diversos disolventes que se
emplean son:
Alta pureza (del orden de 99,999%).
Compatibilidad con el detector.
Solubilidad de la muestra.
Baja viscosidad.
Inercia química.
Precio razonable.
Fase móvil

Las propiedades de los eluyentes que se pueden variar para

producir elución en gradiente son:

Fuerza iónica.
pH.
Constante dieléctrica.
 Fase normal y reversa

 Actualmente en desuso ya que ciertos solventes modifican de a poco

la fase estacionaria, perdiendo reprudicibilidad.

 La fase móvil es polar

 En estas condiciones los compuestos menos polares son mas

retenidos eluyendo primero los mas polares junto con la fase móvil

 Son actualmente las mas utilizadas y su vida media es mayor a las de

fase normal
Cromatografía de reparto

La más antigua es la de equilibrio líquido –líquido pero

actualmente es mas utilizada la de fase enlazada .

La desventaja más importante de la líquido – líquido es la

pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo
que requiere recubrimientos periódicos del soporte