PRUEBAS DIAGNÓSTICAS

PARA VIH
ÁNGELA VICTORIA YOVERA PUICAN
MÉDICO PATÓLOGO CLÍNICO
 Morfología
y Estructura del HIV
 Conceptos Básicos Envelope
• Familia: Retroviridae

• Género: Lentivirus

• Forma esférica, ≈110nm, RNA

• 5´-gag-pol-env-3´

Capsíde
viral

TR integrase
e protease
HIV1
Provirus
ciclo de vida del HIV
 Pruebas laboratoriales
INDICACIONES
 Adolescentes y adultos entre 13- 64 años que tienen o han tenido
relaciones sexuales sin protección o con pareja inestable.
 Antecedentes de infección de transmisión sexual.
 Antecedente de tatuaje o piercing con instrumentos parcialmente
contaminados.
 Usuarios de drogas intravenosas.
Contactos de caso positivo. Consentimiento
 Solicitud voluntaria de la prueba.
informado- consejería
Niño, hijo de madre positiva.
 Pruebas laboratoriales
MÉTODOS INDIRECTOS
• Pruebas rápidas .
• EIA.
• Western blot.
• Inmunofluorescencia indirecta
(IFI).
•Radioinmunoprecipitación (RIPA).
•Inmunoensayo lineal (LIA).
MÉTODOS DIRECTOS
• Cultivo vírico.
• Detección de antigenemia
(antígeno p24).
• Detección molecular de ADN
provírico y ARN vírico.
• Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
• ADN ramificado (bDNA).
• Amplificación basada en la
transcripción o TMA (NASBA).
 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
MUESTRA
 Suero.
Temperatura ambiente: hasta 24 horas.
 2- 8 °C: 1- 7 días.
 -20° a -80° C: más de 7 días.
 No someter las muestras a múltiples ciclos de congelación y
descongelado.
 No deben inactivarse por calor.
• Ensayos de cribado: identifican las muestras reactivas y deben tener
sensibilidad superior
• Confirmación: permite conocer si las muestras contienen anticuerpos
específicos para el VIH ½ y deben tener especificidad superior.
Tabla I.
Técnicas de laboratorio para el diagnóstico de la infección por VIH

a. Pruebas de screening serológicas

I. Técnicas inmunoenzimáticas (EIA)

• Primera generación: EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico,
relativamente sensible, carecen de especificidad y se detectan a los 40 días de
infección.
• Segunda generación: EIA indirecto o competitivo con antígeno obtenido de proteínas
recombinantes y/o péptidos sintéticos, detectan anticuerpos frente a subtipos M, N y
O y frente al VIH-2. Tiempo de detección de anticuerpos: 33- 35 días de infección.
• Tercera generación: EIA de tipo sándwich o de inmunocaptura, con antígeno obtenido
de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y detección conjunta de
anticuerpos específicos de clase IgG, IgM. Tiempo de detección 20- 25 días.
• Cuarta generación: Detección combinada de anticuerpos específicos y antígeno p24.
Tiempo de detección: 13- 15 días.
 ELISA
 An enzyme-labeled
IgG, IgM, or IgA
conjugate is added,
and a substrate
detects the
presence of Ac.
FALSO NEGATIVO:
• Primera fase de infección hasta que se produce la
seroconversión.
• Estadíos finales de la infección.
• Pacientes con tratamiento inmunosupresor.
• Trasplantados de médula ósea.
a. Pruebas de screening serológicas

II. PRUEBAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO

• Generan resultados en menos de 30 min.
• OMS recomienda el uso de pruebas rápidas en entornos de recursos limitados.
• Muestra: fluido oral, sangre capilar, suero, plasma.
• Emplean antígenos similares a los inmunoensayos.
• No pueden identificar infecciones agudas.
Pruebas de Detección
ELISA
Detección de Anticuerpos (resultado en horas)

PRUEBAS RAPIDAS:
Resultado en minutos

Nos dan RESULTADOS PRELIMINARES, requieren prueba confirmatorias

b. Pruebas confirmatorias

I. Western blot
II. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
III. Inmunoensayo lineal (LIA)
Western Blot
 Técnica mediante la cual se separan proteínas por electroforesis en
gel de poliacrilamida y después se transfieren electroforéticamente
a un papel de nitrocelulosa o una membrana similar, donde son
detectadas con anticuerpos que reconocen los antígenos que hay en
ellas.
Etapas principales:

 Separación por electroforesis según pesos moleculares (SDS-PAGE)

 Transferencia a membrana de nitrocelulosa , incubación con suero

problema,

 Incubación del conjugado (por ejemplo enzimático),

 Revelado y

 Examen contra patrón de pesos moleculares.

 WESTERN BLOT
gp160
gp120
p6
p51
5
lisado de gp41
HIV-1 p31
p24
p1
gel 8 papel de nitrocelulose

tira após
obtenção
de cor
tira de papel incubada
papel de nitrocelulose cortado com o soro teste
em tiras
WESTERN BLOT

Antígeno

E Anticorpo
1ario
E
Conjugado

Legenda
Esquema
Western Blot

 Se requiere un patrón con Bandas de las siguientes Proteínas:

p24, gp41 y gp120/160.

 Es una prueba de electroforesis de proteína.

 La desventaja es que es cara, compleja requiere de un proceso de 7

pasos. (incubación entre 4 a 24 horas), dificultad en lectura de banda.
 Ausencia de bandas se interpreta como resultado negativo.
Criterios de interpretación del Western blot para infección
por el VIH, según algunos organismos internacionales
Resultado indeterminado:
• Infección aguda.
• Estadío muy avanzado de la enfermedad.
• Recién nacidos de madres seropositivas.
• Sueros inactivados por el calor.
• Pacientes con factor reumatoide.
• Reacciones cruzadas con otros retrovirus.
WESTERN BLOT
 WESTERN BLOT
Incubacion con la muestra
WESTERN BLOT
Aplicacion de conjugado
WESTERN BLOT
Substrato - revelación
INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
 Usa material humano de Células T infectadas que expresan
antígenos de VIH-1.

 Las células se fijan a la superficie de una laminilla de vidrio, se

utilizan células no infectadas como control.

 Cuando los anticuerpos del VIH están presentes en suero o plasma se

unen a las células infectadas pero no a las células no infectadas.
 INMUNOFLUORESCENCIA

El proceso de excitación – emision

IF Directa: Se usa Ac específicos fluorescentes. Se identifica
al microorganismo mediante el Ac marcado.
IF Indirecta : se detecta haciendo reaccionar sobre el inmunocomplejo una
anti Ig marcada con fluoresceína. Es más sensible.
Inmunofluorescencia indirecta

Antígeno tisular
Inmunofluorescencia indirecta

suero de paciente(IgG)
Inmunofluorescencia indirecta

+ anti-IgG humana con

marca fluorescente
Inmunofluorescencia indirecta

Microscopio
de luz UV
 LECTURA
Examinar las celulas con un microscopio de fluorescencia (250 – 400x)
Seleccionar campos de distribución uniformes
La inmunofluorescencia indirecta se ha utilizado ampliamente como
prueba confirmatoria para la infección por el VIH-1 y lo siguen haciendo
laboratorios con amplia experiencia con la prueba. Su desempeño es
bueno pero requiere de personal debidamente entrenado para su
lectura y de microscopio de fluorescencia.

ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INFECTOLOGÍA

Infectio 2006; 10(4): 273-278
 LIA: inmunoensayo lineal
 Incorporan en un soporte plano ,equivalente a la tira de
nitrocelulosa, varias proteínas recombinantes o péptidos sintéticos
correspondientes a diferentes proteínas del VIH-1 y en algunos
casos del VIH-2
 Su sensibilidad es similar al WB y presenta menos reacciones
cruzadas por la presencia de productos celulares propios del proceso
de fabricación de WB.
 Estas pruebas que son sensibles y especificas pueden considerarse
como pruebas confirmatorias y en algunos sitios reemplazan al WB.
 La presencia de péptidos sintéticos puede ocasionar resultados falsos
negativos en la infección VIH aguda y en niños.
 RIPA
 Técnica limitada a laboratorios capaces de lograr la propagación del VIH-1
en cultivos celulares.
 El virus que crece en células H9 se expone, al alcanzar un crecimiento
exponencial, a una substancia radiomarcada que tras el procesamiento
permite detectar por autorradiografía los inmunoprecipitados que se han
formado.
 Se considera más sensible que el WB frente a las proteínas de alto peso
molecular aunque puede detectar peor la p24.
2. MÉTODOS DIRECTOS

a. Cultivo vírico
b. Detección de antigenemia (antígeno p24)
c. Detección molecular de carga viral.
CULTIVO DE VIRUS
 Requiere infraestructura de alto nivel de bioseguridad.
 Poco sensible cuando se usa suero o plasma.
 Las células mononucleares son más adecuadas especialmente si están
reducidas o agotadas de CD8+.
DETECCIÓN DE ANTÍGENO P24
 Aparece en sangre después de la infección por VIH.
 Coincide con aumento de ARN viral.
 S: 89% E: 100%.
 El ensayo detecta nivel que corresponde a un nivel de ARN de 30000-
50000 copias/ml.
DETECCIÓN DE CARGA VIRAL PLASMÁTICA
 Se expresa comonúmero de copias/ ml o en log10.
Junto con recuento de linfocitos CD4, son parámetros que se utilizan
en la monitorización del tratamiento antiretroviral.
Muestra: sangre anticoagulada con EDTA en cantidad de 5- 10 ml.
Para Dx de niños menores de 18 meses.
 Aclarar resultados indeterminados.
Principal uso: seguimiento de la infección y el de terapia.
• Respuesta virológica:

• Reducción de la CVP superior a 1 log10 tras 4 semanas desde inicio de TAR.

• CVP menor de 50 copias/ml tras 16-24 semanas de iniciado el TAR.

• Fracaso virológico:
• CVP detectable tras 24 semanas de inicio de TAR.
• Si tras alcanzar la CVP indetectable, esta se vuelve superior a 50 copias/ml en
dos determinaciones consecutivas.

En pacientes con CVP muy elevadas (más de 300 000 copias/ml) pueden
requerirse más de 24 semanas para obtener un CVP indetectable.
INFECCIÓN AGUDA
• Primera etapa de infección.
• 50% desarrollan manifestaciones clínicas sugestivas.
• Niveles elevados del virus.
• No es detectada por pruebas convencionales.
• Disminución de carga viral y de antígeno p24 coincide con el
incremento de niveles de anticuerpos.
• Se puede diagnosticar:
• Detección de ARN- VIH.
 DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR
VIH EN EL NIÑO
 Técnica recomendable: detección de ácido nucleico o aislamiento viral.
 1/3 son detectados a los 10 días de vida.
 50% en primeras 4 semanas, el resto en los siguientes 2 meses.
 En niño > 18 meses, se pueden realizar las mismas pruebas que se
realizan en el adulto.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
PRUEBAS DE TAMIZAJE

 FALSOS POSITIVOS:
 Más comunes.
 Multiparidad.
 Enfermedad reumática.
 Enfermedades infecciosas.
 Vacunación reciente para hepatitis B.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
PRUEBAS DE TAMIZAJE
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
PRUEBAS DE TAMIZAJE

 FALSOS NEGATIVOS:
 Fases iniciales: periodo de ventana.
 Fases finales:
 Baja producción de anticuerpos.
 Infecciones silenciosas.
 Limitantes de la prueba (detectar variantes como grupo O o
VIH-2)
 Transfusión masiva.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS DE
PRUEBAS DE TAMIZAJE
Prueba Indeterminada:

 Elisa (+) WB gp41 (una banda solamente)

 RNA PCR, para aclarar la infección

 Las pruebas pueden ser positivas de 3 a 12 semanas posterior a la

infección
Algoritmo de diagnóstico por laboratorio para
la infección por el VIH

Infectio 2006; 10(4): 273-278

GRACIAS