VIROLOGÍA

CÓRDOVA SUCLUPE, JHONATAN J.

 MODELO DE INFORME DE
PRÁCTICA
Interpretació
Portada Introducción Resultados
n

Referencias
Discusión Conclusiones Bibliográfica Anexos
s

Estilo APA, 2016

 BIOSEGURIDAD
PILARES
Doctrina de Conjunto de
comportamiento medidas mínimas a
encaminada a ser adoptadas con el
lograr actitudes y fin de reducir o

Uso de Barreras

Eliminación de
Universalidad

contaminado
conductas que eliminar los riesgos

Medios de
disminuyan el para el personal, la

material
riesgo del comunidad y el
trabajador a ambiente por
adquirir en el agentes físicos,
medio laboral. químicos y
mecánicos.
GRUPOS DE RIESGO • RI / RC • RI / RC
escaso o bajo
nulo
G.R. G.R.
01 02

G.R. G.R.
04 03
• RI / RC • RI
elevado elevado
/ RC
bajo
NIVELES DE LABORATORIO
NIVELES DE TIPO DE LABORATORIO PRACTICAS DE LABORATORIO
BIOSEG.
Técnicas microbiológicas
BSL – 1 Básico de enseñanza
apropiadas – TMA
Servicio de Dx primario de TMA + EPP + Señal de
BSL – 2
salud e investigación. biopeligro.
BSL – 2 + EPP especial + Acceso
Servicio de Dx especializado
BSL – 3 controlado + Flujo direccional de
e investigación.
aire.
BSL – 3 + Acceso de transfer +
Unidad de Dx e investigación
BSL – 4 Uso de regadera al entrar y
en patógenos especiales.
salir.
 CÁMARA DE SEGURIDAD BIOLÓGICA
• OMS, diseñada para proteger al trabajador, al ambiente del laboratorio y
los materiales de trabajo de la exposición a salpicaduras y aerosoles
infecciosos.
Vel. del aire: 0.38 Protección al Protección al
m/s, pasando por personal. personal de mayor
encima de la Filtro de aire a través nivel.
superficie de trabajo Filtros HEPA. Todos los orificios

CLASE III
y sale de la cámara

CLASE II
G.R. clase 2 y 3. están sellados para
CLASE I

por el conducto de impedir el paso de

extracción. gases.
Proporciona
protección al G.R. clase 4
personal y ambiente. Entrada de aire
filtrado por 01 HEPA
y salida 02 HEPA.
 ORGANIZACIÓN
DEL LAB. DE
VIROLOGÍA
Canton et al., 2012
• Nivel de Contención 2,3,4.
• Aire acondicionado especifico con
Filtros HEPA.
• Cabinas de Bioseguridad II y III.
• Acceso restringido con señalización.
• Dimensión 14 – 18 m2 por trabajador.
 CUESTIONARIO Nº 01
• Explique la importancia y uso de los filtros HEPA
• ¿Es importante el uso de EPP y realizar la desinfección del área de
trabajo? FUNDAMENTE
• Elabore un cuadro comparativa con los Requisitos Ingenieriles en
función de los niveles de Bioseguridad
• Elabore un cuadro diferencial en niveles de Bioseguridad de
Laboratorios en función a protección primaria, Barreras primarias y
secundarias.
MATERIALES Y EQUIPOS DE
VIROLOGÍA
CÓRDOVA SUCLUPE, JHONATAN J.
 PLACAS DE CULTIVO CELULAR
MULTIPOCILLOS

Recipiente redondo, hecho de vidrio o

de plástico, posee diferentes
diámetros, es de fondo bajo, con una
cubierta de la misma forma que la
placa
FRASCOS DE ROUX
Diseñados y tratados para
promover la adherencia y
crecimiento de células. Fabricados
en poliestireno, son estériles y con
áreas de crecimiento de 25cm2
hasta 225cm2.
TUBO DE LEIGHTON

Tubos de vidrio, cerca de su base

tienen una abertura. Dicha
abertura tiene un calibre para que
pueda entrar una laminilla, la cual
se sumerge en el medio que
contiene el tubo. En la laminilla se
puede desarrollar los tejidos, para
luego poderlos observar.
EQUIPOS DE LAB DE VIROLOGIA
 CUESTIONARIO Nº 02
• ¿Cuálescree usted que serían los materiales y equipos
fundamentales en el Lab. De virología?
• ¿El microscopio electrónico es un equipo fundamental en el estudio
de ultraestructura de virus? FUNDAMENTE
• Elaboreun cuadro comparativo de las diferencias y semejanzas
del MET y MEB.
• Elabore el resumen de la Lectura Nº 01 – Sub-grupo
AISLAMIENTO DE
BACTERIÓFAGOS

CÓRDOVA SUCLUPE, JHONATAN J.

• Numerosas técnicas y/o metodologías
 Secreciones y líquidos corp.
• Joklick, 1980: Mx procesadas
inmediato; -70°C – buffers.
• Fenner et al., 1992: Al inocular la
muestra al huésped  Filtración.
 [ ] virus   [ ] antibióticos.
• Sandin y Algorta, 2004: Herramienta
importante de Dx, con el fin de
identificar  Epidemiología.
FILTRACIÓN
Oliva y Herrera: Separación mediante la difusión selectiva de un
componente a través de los poros de la membrana siendo la presión
al vacío la fuerza impulsadora (F.I.), esta se debe al gradiente de:

• PRESION 𝑉𝑒𝑙. 𝑑𝑒 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =

𝐹. 𝐼.
• TEMPERATURA 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑠𝑡𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎
• CONCENTRACIÓN
• POTENICIAL ELÉCTRICO
TIPO DE FILTRACIÓN
F. A TRAVÉS DE F.
F. PROFUNDA
LA MEMBRNA COMBINADA
Es la asociación de
Mecanismo que
varios tamaños del
atrapa o retiene el
poro o la
contaminantes
Mecanismo en el combinación de
dentro de la
cual se atrapan FP/FAM para crear
matriz y en la
unidades de
superficie del
filtración en una
material filtrante.
sola pieza,
FILTRACIÓN SEGÚN EL FLUJO
• Fluido va directamente hacia la
FLUJO DE membrana bajo la presión del
FILTRACIÓN vacío en mismo sentido, siendo así
NORMAL – que las partículas grandes quedan
FFN: retenidas y las pequeñas pasan.

• Fluido va directamente hacia la

FLUJO DE membrana bajo la presión del
FILTRACIÓN vacío transversal.
TRANSVERSAL
– FFT
FILTRO DE MEMBRANA
Son filtro de superficie, retención de partículas en la superficie.
Estructura y distribución del poro es uniforme, permite determinar el tamaño
máximo de partículas que lo atraviesan.

Grado de filtración absoluto y una elevada velocidad de flujo.

Hidrofilica, con porosidad de 66 – 84%.

Biológicamente inerte y de estabilidad térmica.

Nitrocelulosa: Nitrato + Acetato de celulosa.

TAMAÑO DEL PORO.
PARTES DEL EQUIPO DE FILTRACIÓN
 Agregar 4 – 5
Frasco: 50 mL de Incubar 4 - 5 h a
colonias (Cultivo
PROTOCOLO CDC
problema)
37 °C

Agregar 50 mL
Incubar 37°C x 18
de agua servida Refrigerar 1 h
– 20 h
filtrada

Centrifugar 5000
Filtración a través Obtención de
rpm x 15 – 20
de la membrana FAGOS
min
 PRUEBA DE LISIS
Sembrar cultivo Sembrar en A.T.
problema en Incubar a 37° C en difusión con
C.T. hisopo

Incubar 18 – 24 Agregar el Secar a T° amb

H inóculo fágico 5 min
RESULTADOS
Después del proceso de incubación el resultado
puede ser:
• Fago lítico, el de interés, que se manifiesta
sin crecimiento bacteriano en el área del
inóculo como se muestra en la FIG 1.
• Fago lisogenico, se manifiesta poco
crecimiento bacteriano en el área del inóculo
en la FIG 3.
• Si guardan en refrigeración la placa de lisis,
por 18-20 horas, intensificará el área de lisis
FIG TS.
CUESTIONARIO Nº 03
• Establezca diferencias y semejanzas entre las diferentes clases de
Filtro de Membrana.
• ¿Es importante la selección del tamaño del poro para el
aislamiento viral y/o bacteriófagos? FUNDAMENTE.
• ¿Cómo influye la Gradiente del Potencial eléctrico, de
concentración y temperatura en la Fuerza impulsadora en la
velocidad de la filtración?
• ¿Quécaracterísticas básicas debe presentar los Filtros de
Membrana para su utilización?
TITULACIÓN VIRAL
CÓRDOVA SUCLUPE, JHONATAN J.
 CONCEPTOS BÁSICOS
• Conocido como Cuantificación viral.
• Considerada Prueba por Excelencia / Gold Standart.
• Es la medición de la actividad biológica de una suspensión viral.
• Primer sistema Nicotiana tabacum, siendo el 1º método “Ensayo de
lesiones locales”
Detergente abrasivo  Ruptura P.C.  Aplicación del VMT
• Explica: El NÚMERO de lesiones observadas será proporcional a la [ ]
de partículas virales infectivas. Ej:
1.0 mL VMT  500 lesiones necróticas
 CLASIFIACIÓN:

Llop et al., 2001 Whitney et al., 2005

• Métodos físicos: Conteo
directo, no distingue Part.
Infectivas y no infectivas. Ej:
RIA, ELISA, ME
• Métodos químicos: Número de
unidades infectivas por unidad
de volumen  Reacción
reconocible. Ej: DL50, UFP, Spot
Test.
• Determinan partículas
virales infectivas: Ej.: DL50,
UFP en placas, Turbidometría
en caldo, Citometría de flujo.
• Determinan partículas
virales totales: Ej.: ELISA,
ME, MALDI-TOF, HA, IHA,
Cromatografía líquida.
ZAPATA, 2000.
• TITULO: es el calculo de Nª de calvas de la última dilución por el
inverso de la dilución y el inóculo.
• La suspensión fagica se mezcla con el exceso de bacterias
susceptibles, que se extienden sobre el agar. Las baterías no
infectadas crecen, mientras que las infectadas replican el virus y lo
diseminan a las bacterias vecinas, de tal manera que muere el
grupo de bacterias alrededor de la bacteria infectada
originalmente, dejando un área o foco libre de células
denominadas calvas o placas de lisis.
Se realizan diluciones
decimales de la suspensión
fágica las cuales se cubren en
un medio con el fin de limitar el
desplazamiento del fago,
formando un monocapa de
bacteria, utilizando A.A.
encargándose de colorear las
zonas (BNI) sin dañar ni matar
a la célula huésped o al virus.
En aguas
superficiales
(Rohwer & En el suelo
Edwards, 2002), (Marsh et al.,
en aguas 1994; Kimura et
residuales al, 2008)
(Sabouri, 2013;
Gaviria et al.,
2012)

Mundo,10^30 –
10^32 fagos/mL
Intestino humano : Goyal, 2006 y
(Breitbart et al., Aguas
2003; Mills et superficial,
al., 2013). 10^10
fagos/mL:
Robwer, 2002
 PROTOCOLO

𝑁º 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑣𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 ú𝑙𝑡𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

• 𝑇𝐼𝑇𝑈𝐿𝑂 = 𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜

• Descripción de la calva a 24 y 48 hr.

 RESULTADOS
Dilución Nº UFC Dilución Nº UFC Dilución Nº UFC
10-1 NC 10-1 NC 10-1 NC
10-2 NC 10-2 NC 10-2 NC
10-3 NC 10-3 838 10-3 NC
10-4 398 10-4 598 10-4 NC
10-5 258 10-5 238 10-5 238
10-6 65 10-6 85 10-6 278
10-7 5 10-7 105 10-7 155
10-8 - 10-8 23 10-8 83
 CUESTIONARIO Nº 04
• Explique y defina multiplicidad de infección viral.
• Fundamente los métodos actuales para la cuantificación de componentes virales.
• ¿Qué otros medios se pueden utilizar para titular bacteriófagos? Describa su
composición y fundamento.
• Parausted, ¿Cuáles de los medios encontrados seria el ideal para el uso del
protocolo de la practica? FUNDAMENTE
• Describa el fundamento y metodología de la técnica del Spot Test en titulación
de fagos.
• Mencione las ventajas y desventajas de los 3 métodos de titulación de fagos
estudiados.