PRÁCTICA N°01:

EXTRACCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DE ADN
GENÓMICO A PARTIR DE
SANGRE PERIFÉRICA
 OBJETIVO

Realizar procedimientos de extracción, purificación y

cuantificación de ADN a partir de sangre periférica
con una calidad suficiente para análisis por PCR.
INSUMOS Y REACTIVOS
 PROCEDIMIENTO

1.- CENTRIFUGAR TUBOS 2.- EXTRACCION DEL BUFFY COLOCARLO EN UN

EDTA A 4 000 rpm POR 10 COAT 200 uL CON PIPETA DE EPPENDORF DE 1.5mL
MINUTOS TRANSFERENCIA
 PROCEDIMIENTO

3.- AÑADIR 40 ul VORTEXEAR BIEN PARA EVITAR LOS INCUBAR TºAMB POR
PROTEINASA K COAGULOS 5MINUTOS
 PROCEDIMIENTO

4.- AÑADIR SOLUCION DETERGENTE HOMOGENIZAR INCUBAR 65ºC POR UM TIEMPO

S. detergente : Dodecilsulfato sódico VIGOROSAMENTE VORTEX DE 30 MINUTOS
 PROCEDIMIENTO

5.- LA MUESTRA CAMBIA A UN AÑADIR 300 uL alcohol HOMOGENIZAR RAPIDAMENTE

COLO VERDE, INDICA QUE ESTA ETILICO AL 96% MEDIANTE VORTEX
DIGERIDA
 PROCEDIMIENTO

6.- TRANSFERIR LA MUESTRA A LAS CENTRIFUGAR A 8 000 rpm POR

MICROCOLUMNAS 60 SEGUNDOS
 PROCEDIMIENTO

7.- DESCARTAR EL TUBO DE COLOCAR 500uL BUFFER CENTRIFUGAR POR 8 000 rpm
COLECCIÓN REEMPLAZAR POR DE LAVADO W1 POR 60 SEGUNDOS
OTRO
 PROCEDIMIENTO

8.- DECARTAR EL TUBO DE COLOCAR 500uL BUFFER CENTRIFUGAR 8 000 rpm

COLECCIÓN Y REEMPLAZAR LAVADO W2 POR 3 MINUTOS
POR OTRO
 PROCEDIMIENTO

9.- DESCARTAR EL TUBO DE AÑADIR 100 uL DE BUFFER DE

COLECCIÓN Y REEMPLAZARLO CENTRIFUGAR POR 14 000 rpm POR
ELUCION E INCUBAR 2 MIN Tº 75 SEGUNDOS
POR UN CRIOVIAL EPPENDORF DE AMB
1.5 mL
PROCEDIMIENTO

SE OBTIENE EL ADN PARA SU

CUANTIFICACION
 CUANTIFICACION DE ADN
MEDIANTE ANALISIS DE IMAGEN Y
ELECTROFORESIS (CUALITATIVO)
MATERIALES Y EQUIPOS
 PROCEDIMIENTO
• ADN SERA DILUIDO 1:2 CON AGUA DE PCR (5uL ADN PROBLEMA Y 5uL AGUA PCR)
• GEL AGAROSA PREPARADO AL 1% (BROMURO DE ETIDIO)
• CARGAR DE 10 A 15uL DE MUESTRA DILUIDAS EN GEL
• CARGAR 10uL MARCADOR LAMBDA HIND III EN GEL
• CORRIDA A 100 VOLTIOS POR 40 MIN COMPARAR INTENSIDAD DE BANDA
• REALIZAR LOS CALCULOS
 CALCULOS - RESULTADOS

EN ESTE PROCESO CUANTIFICAMOS EL ADN POR ELECTROFORESIS CON LA FINALIDAD DE

DETERMINAR SI LA CONCENTRACION OBTENIDA ES LA IDONEA PARA SU POSTERIOR
ANALISIS POR PCR Y SU TIPIFICACION.
 CALCULOS - RESULTADOS
1 2 3 NUESTRA
CONTROL 4 5 6 7
MUESTRA DE
GRUPO FUE LA
Nº7 LA CUAL
TIENE SIMILITUD
CON LA BANDA
Nº2 DEL
CONTROL
LAMBDA

COMPARAMOS NUESTROS 07 MUESTRAS PROBLEMAS

RESULTADOS CON LA BANDA
CONTROL LAMBDA Hind IlI de []
50ng/ul
 CALCULOS - RESULTADOS
REALIZAMOS LOS CALCULOS DE NUESTRA MUESTRA: MUESTRA PROBLEMA

CONTROL 7

COMPARAMOS LA INTENSIDAD DE LA BANDA DE

NUESTRA MUESTRA PROBLEMA (Nº07) CON EL
MARCADOR Lambda Hind III Y ES SIMILAR A LA BANDA 2
DEL MARCADOR, LA CUAL TIENE 9.42 Kb DE PESO

CONVERTIMOS 48.37 Kb EN pb (PESO TOTAL DEL

MARCADOR) SIENDO 48377 pb EL 100%
Y CONVERTIMOS EL PESO DE LA BANDA 2: 9.42 KB A
PB= 9420pb
 CALCULOS - RESULTADOS
COMO SE CARGO 5uL DE MUESTRA
PROBLEMA Y 5ul DEL MARCADOR Lambda
Hind III YA NO SERIA 500ng SU
CONCENTRACION DE ESTE SINO 250ug

REALIZAMOS LA REGLA DE TRES SIMPLE:

SI: 48377pb-------- 250ng
9420 pb ------- X
X= 49 DE CONCENTRACION

DEBEMOS DIVIDIRLA ENTRE 5 uL PUES FUE LA

CANTIDAD QUE SE CARGO EN EL PROCESO DANDO:
9.8ng/uL

MULTIPLICAMOS LA [] 9.8ng/ul x factor de

dilución(2)= 19.6ng/ul [] final
 CONCLUSIONES
• FUIMOS 7 LOS GRUPOS PARTICIPANTES DE LOS CUALES SE ESCOGIO LA MUESTRA MAS
OPTIMA PARA REALIZAR LA TIPIFICACION MOLECULAR HLA POR PCR SSP.
• PUDIMOS OBSERVAR QUE EN EL PASO N°6 LA MUESTRA ESTABA COAGULADA
POSIBLEMENTE PORQUE NO HUBO UNA BUENA HOMOGENIZACION EN EL PASO 3 DONDE
AGREGAMOS LA PROTEINASA Y LA MEZCLA EN EL VORTEX NO FUE RAPIDA O EN EL PASO
4 AL AGREGAR EL DETERGENTE.
• LA MUESTRA ELEGIDA FUE LA NUMERO 6 POR RECOMENDACIÓN DE LA ASISTENTE DE
PRACTICA , SE HICIERON LOS CALCULOS COMPARANDO EL RESULTADO CON EL
MARCADOR DE PESO MOLECULAR PATRON LAMBDA HIND III OBTENIENDO UNA
CONCENTRACION FINAL DE 48NG/UL SIENDO EL VALOR MAS CERCANO A 50 NG/UL []
MINIMA REQUERIDA POR EL KIT, PARA EL PROCESO DE TIPIFICACION MOLECULAR.
TIPIFICACION MOLECULAR HLA PCR- SSP
LOCI A, B, DRB1, DQB1
 MATERIALES Y EQUIPOS

Platinum Taq DNA MICROPIPETAS Y AGUA PCR

polymerasa

Sistema de documentación de geles

Gel Doc XR (Bio-Rad)

GEL AGAROSA
96 POCILLOS
 PROCEDIMIENTO

1.- SE AGREGO 11ul AL POCILLO A12 DEL

2.- AGREGAMOS LOS 7ul Taq POLIMERASA
MASTER MIX ANTES DE AGREGARLE LA Taq
A NUESTRO MASTER MIX Y DISPENSAMOS
POLIMERASA PARA NUESTRO CONTROL DE
11UL A LOS POCILLOS RESTANTES.
REACCION(CONTROL NEGATIVO)
 PROCEDIMIENTO

3.-SE CUBRE TODA LA PLACA CON UN ADHERENTE QUE 4.- OBSERVAMOS QUE TODOS LOS POCILLOS
VIENE EN EL KIT ESTAN DISPENSADOS CON LA SOLUCION
 PROCEDIMIENTO

5. DAMOS UNA PEQUEÑA MEZCLA A EN UNA CENTRIFUGA PARA PLACAS

NUESTRA MUESTRA EN PLACA

AREA DE PRE- PCR:
ENCONTRAMOS VARIAS AREAS
COMO RECEPCION REGISTRO E
IDENTIFICACION DE MUESTRAS.
PROCEDIMIENTO
AREA DE PRE- PCR:
TAMBIEN EL AREA DE AREA DE PCR: ENCONTRAMOS 2
PREPARACIONES DE AREAS
REACTIVOS- INSUMOS AREA TERMOCICLADORES Y
TENEMOS USO DE GABINETES AREA DONDE SE AGREGA EL PCR
CON UV
 PROCEDIMIENTO

AREA DE POST- PCR:

AREA DE POST- PCR:
GRAN FUENTE DE CONTAMINACION.
DIFERENTES AREAS
AREA DE ELECTROFORESIS
AREA DE HIBRIDACION
AREA DE SECUENCIACION AREA DE POST- PCR:
EQUIPO FOTODOCUMENTADOR
 INTERPRETACION DE LOS
RESULTADOS OBTENIDOS DEL
PCR SSP
HERRAMIENTAS - SOFTWARES
- COMPUTADOR
- SOFTWARE UNIMATCH Invitrogen
Y E-EDITOR
- PROGRAMA INTERNET PARA ALELOS
FRECUENTES
RESULTADOS DE LAS BANDAS EN PLACA

RESULTADOS EN GEL DE AGAROSA

HACEMOS USO DEL SOFTWARE UNIMATCH QUE ES UNA PLANTILLA DONDE
OBSERVAMOS LAS BANDAS
RESULTADOS ALELOS ESPECIFICOS
OBTUVIMOS LAS SIGUIENTES AMPLIFICACIONES
(DATOS) QUE LLEVAMOS AL SOFTWARE
UNIMATCH PARA SU INTERPRETACION:
Bandas:16 18 20 29 30 32 42 47 49 54
55 74 85 89 94
 RESULTADOS EN PLACA

AL ALINEAR SE INDIVIDUALIZA LAS BANDAS Y

PODEMOS ORDENAR LOS DATOS PARA SU
INTERPRETACION EN EL SOFTWARE UNIMATCH

USAMOS EL E-EDITOR PARA QUE SE ALINE LA IMAGEN Y

HACER MEJOR USO DE ESTE
INTREPRETACION DE LAS BANDAS
OBSERVAMOS DE FORMA HORIZONTAL
LA PRIMERAA BANDA ES LA DE CONTROL B-globina.
TODOS LOS CARRILES DEBE DE HABER LA BANDA
CONTROL PARA DAR POR VALIDADA.
HUBO AMPLIFICACION SI OBSERVAMOS BANDAS
DEBAJO DE LA DE CONTROL.
SI SE OBSERVA SOLO 1 BANDA EN EL INFERIOR
TAMBIEN SE CONSIDERA QUE HA AMPLIFICADO, ESTE
FENOMENO SE CONOCE COMO FENOMENO DE
COMPETENCIA.
 USO DEL SOFTWARE

INGRESAMOS EL LOTE QUE HEMOS USADO EL SOFTWARE UNIMATCH NOS BRINDA LOS
AL SOFTWARE UNIMATCH E INGRESAMOS LOS RESULTADOS DEL TIPAJE HLA DE NUESTRA
DATOS MUESTRA PROBLEMA
USO DEL SOFTWARE

INGRESAMOS LOS DATOS OBTENIDOS .

VEMOS LAS LINEAS VERDES EN EL
SOFTWARE

AQUÍ NOS MUESTRA EL TIPAJE DEL HLA

OBTENIDO
 USO DEL SOFTWARE

NUESTROS RESULTADOS DEL TIPAJE HLA

MUESTRA PROBLEMA
 USO DEL SOFTWARE

NUESTROS RESULTADOS DEL TIPAJE HLA

MUESTRA PROBLEMA
USO DE INTERNET ALELOS FRECUENTES

EN INTERNET www.allelefrequencies.net
PAGINA QUE NOS OFRECE LAS FRECUENCIAS DE ALELOS
EN DIFERNETES PAISES
 USO DE INTERNET ALELOS FRECUENTES

EL HLA-A *31 OBTENIDA EN NUESTRA MUESTRA

ES MUY FRECUENTE EN EL ARGENTINA CON UN
EL HLA-A *2 OBTENIDA EN NUESTRA MUESTRA 59.3%
SOLO UN 0.6340% EN EL PERU
USO DE INTERNET ALELOS FRECUENTES

EL HLA-DRB1*08, HLA-DRB*08 ES MUY FRECUENTE

EN EL PERU
 CONCLUSIONES
• HEMOS REALIZADO LA IDENTIFICACION DE anti-HLA HUMANO UTILIZANDO LOS
SOFTWARES CORRESPONDIENTES PARA TIPAJES MOLECULAR PCR- SSP Loci A, B, DRB1,
DQB1 SOFTWARE SP-Unimach Y E-DITOR DETECTANDO ANTICUERPOS HLA QUE SON
CLINICAMENTES IMPORTANTES EN EL RECEPTOR.
• UNA PRUEBA EXITOSA MUESTRA LA BANDA CONTROL EN CADA REACCIÓN NEGATIVA Y LA
BANDA DE TAMAÑO APROPIADO EN LOS POZOS POSITIVOS. SI UNA REACCIÓN DE
AMPLIFICACIÓN NO MUESTRA BANDAS DESPUÉS DE LA ELECTROFORESIS, EL PROCESO DE
AMPLIFICACIÓN FALLÓ, LO QUE PUEDE DEBERSE AL CONTROL INADECUADO DE LA
TEMPERATURA DEL BLOQUE DEL TERMOCICLADOR, CANTIDAD INSUFICIENTE DE DNA O
FALLA AL ADICIONAR LA TAQ POLIMERASA.
 CONCLUSIONES
• ESTA PRUEBA SE REALIZA EN UN TIEMPO DE TRES Y MEDIA A CUATRO HORAS, CON UN
JUEGO DE INICIADORES. SE PRESENTAN AMBIGÜEDADES A NIVEL ALÉLICO EN 5 A 10 %
DE LAS TIPIFICACIONES, DEPENDIENDO DE LA POBLACIÓN EN ESTUDIO.
• LA PRINCIPAL DESVENTAJA DE LA TÉCNICA ES LA NECESIDAD DE UTILIZAR GRAN
NÚMERO DE PAR DE INICIADORES PARA REALIZAR LA TIPIFICACIÓN DE UN SOLO
PACIENTE, EL CUAL OCUPA UN TERMOCICLADOR (96 POZOS), POR LO QUE NO ES
RECOMENDABLE PARA GRANDES VOLÚMENES DE TRABAJO, SIENDO LA LIMITANTE EL
NÚMERO DE TERMOCICLADORES Y LAS UNIDADES DE ELECTROFORÉSIS.
• PARA ALTO VOLUMEN DE TRABAJO, LA TÉCNICA PCR-SSO SE CONSIDERA MÁS
PRÁCTICA. SSP PUEDE SER UTILIZADO PARA COMPLEMENTAR LA TÉCNICA DE SSO,
DANDO RESOLUCIÓN A NIVEL ALÉLICO CUANDO SEA NECESARIO.
 CONCLUSIONES
• LA PRÁCTICA REALIZADA EN CLASE SOBRE LA EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN
GENÓMICO PARA LUEGO CUANTIFICARLO Y LOGRAR REALIZAR EL TAMIZAJE PARA
DETERMINAR LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS TOTALES IGG ANTI-HLA HUMANO
UTILIZANDO EL SOFTWARE DE INTERPRETACIÓN SSP-UNIMACH, NOS HACE VER LA
IMPORTANCIA DEL LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD EN LOS PROGRAMAS DE
TRASPLANTE DE ÓRGANOS PARA DETERMINAR EL GRADO DE COMPATIBILIDAD QUE
EXHIBE LA PAREJA RECEPTOR/DONADOR PARA EL TRASPLANTE.
• PARTE DE LA RESPONSABILIDAD DEL LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD ES LA
DETECCIÓN EN EL RECEPTOR DE ANTICUERPOS ANTI–HLA CLÍNICAMENTE RELEVANTES
DIRIGIDOS EN CONTRA DE LAS ESPECIFICIDADES ANTIGÉNICAS DE SU POTENCIAL
DONADOR.
 INTEGRANTES: GRUPO 01
• Arias Guzmán, Belinda Morayma
• Bautista Salas, Selene Adelis
• Castillo Carbajal, Nelly Elizabeth
• Corilloclla Flores, Rosa Amelia