You are on page 1of 38

Mikrobiološki

preparati
Mikrobiološki preparati
- mikrobiološke preparate pravimo u cilju posmatranja
MO (morfologija, struktura, oblik, raspored ćelija,
pokretljivost…)
- Preparat može da bude:
1. Nativni preparat - posmatranje živih MO
2. Fiksirani preparat
Nativni preparat
• posmatranje živih MO (pokretljivost)
• nedostatak-slaba vidljivost, mogućnost infekcije,
jednokratna upotreba
• procedura pripreme:
1. na predmetnicu se stavlja uzorak (u slučaju tečne kulture
stavlja se kap suspenzije, u slučaju čvrste podloge u kap
fiziološkog rastvora unosi se materijal iz kulture)
2. pokrovnica
3. mikroskopiranje
Nativni preparat
Fiksirani preparat
• prednosti-višekratna upotreba, ne postoji
mogućnost infekcije, posmatranje strukture, oblika i
morfologije, ćelije lakše uočljive
• procedura pripreme:
1. nanošenje suspezije na predmetnicu i pravljenje razmaza
2. sušenje na vazduhu
3. fiksiranje (provlačenjem kroz plamen) kako bi ubili MO i
fiksirali ih za predmetnicu
4. bojenje preparata
5. mikroskopiranje
Pravljenje razmaza
Fiksiranje preparata
Bojenje preparata
1. Prosto bojenje - koristi se 1 boja
-uocavanje oblika i rasporeda celija
-boje koje se primenjuju: kristal violet, safranin,
metilensko plavo…
2. Slozeno bojenje - koristi se 2 ili vise boje
-uocavanje morfologije i strukture celije
-tipovi slozenog bojenja: bojenje po Gramm-u,
bojenje acido-alkohol rezistentnih bakterija
,bojenje kapsula, bojenje endospora, bojenje
nukleinskih kiselina, bojenje flagela
Mikrobiološke boje
• organska jedinjenja koja boje odredjene ćelijske
strukture
• Prema poreklu dele se na:
1. prirodne: šafranin (šafran), lakmus (lisajevi)
2. veštačke (anilinske boje)
• soli koje prilikom pravljenja vodenih rastvora
disosuju:
1. bazno – katjonske boje (kristal violet, šafranin…)
2. kiselo – anjonske boje, negativno bojenje (eozin)
3. neutralno-neutralno crveno
Mikrobiološke boje
• Svaka boja mora da sadrži dve grupe:
1. hromoformnu (nosilac karaktera boje, NO2)
2. auksohromnu (el. disocijacija, OH¯, NH2)
Prosto bojenje
• Procedura:
1. Pravljenje razmaza
2. Sušenje (na vazduhu)
3. Fiksiranje
4. Bojenje
-kristal violetom (na predmetnicu staviti filter hartiju i na
nju naneti boju, nakon 1-2 min ukloniti filter hartiju,
preparat isprati vodom, osušiti filter hartijom,
mikroskopiranje)
-šafraninom-postupak je identičan, filter hartiju nije
neophodno stavljati na preparat pre bojenja
Procedura prostog bojenja
Preparat-prosto bojenje
Složeno bojenje-bojenje po
Gramm-u
• 1884. danski histolog Christian Gram razvio metod
bojenja u cilju diferencijacije bakterijskih ćelija i
nukleusa eukariotskih ćelija
• diferencijalna slika (identifikacija Gr+ i Gr- bakterija)
• na osnovu razlike u gradji cel. zida Gr+ bakterije boje
se ljubičasto, dok se Gr- bakterije boje crveno
• metoda se zasniva na sukcesivnoj primeni
– kristal violeta (osnovna boja)
– lugola (učvršćivač) – rastvor I u KI
– etanola (obezbojivač) 70% ili 95%
– šafranin (suprotna boja)
Procedura bojenja po Gramm-u
• Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i
fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata
1. bojenje kristal violetom 1-2 min (neophodno je
staviti na preparat filter hartiju)
2. lugol 1-2 min
3. ispiranje vodom
4. ispiranje etanolom 5-10 sec
5. ispiranje vodom
6. bojenje šafraninom 1-2 min
7. ispiranje vodom, susenje filter hartijom,
mikroskopiranje
Procedura bojenja po Gramm-u
Procedura bojenja po Gramm-u

nakon pravljenja razmaza, sušenja na


vazduhu i fiksiranja pristupa se proceduri
bojenja preparata

inicijalno se boje kristal violetom kako


Gr+ tako i Gr- bakterije

u reakciji kristal violeta i joda


obrazuje se nerastvorljivi
kompleks
Gr+ bakterije imaju deblji mureinski sloj
u ćelijskom zidu, nepropustljiv za
alkohol i boje se ljubičasto
Gr- bakterije imaju tanji peptidoglikanski
sloj u ćelijskom zidu, propustljiv za alkohol
koji rastvara i izvlači kompleks boje i joda
Razlika u gradji ćelijskog zida Gr+ i Gr-
bakterija
Preparat-bojenje po Gramm-u
Sporulacija
• neke bakterije tokom rasta, procesom sporogeneze formiraju
endospore
• rezultat nepovoljnih uslova životne sredine, najčešće u uslovima
limitiranosti nutrijentima (C, N najznacajniji)
• karakteristike spora: odsustvo metaboličke aktivnosti,
rezistentnost prema fizičkim i hemijskim činiocima (t°, UV, boje,
hemijska jedinjenja, suša…) zbog prisustva egzosporijuma
(proteinski omotač)
• u povoljnim uslovima procesom germinacije formira vegetativnu
ćeliju
• jedna bakterijska celija najčešće formira samo 1 sporu
• strukture koje služe za preživljavanje, a ne za razmnožavanje
Sporulacija

• rezistentnost na toplotu pripisuje se dehidriranom stanju i


kalcijum dipikolinatu
• gradja spore: jezgro, zid, korteks, omotač, egzosporijum
• proces sporulacije odvija se u najmanje 7 faza
• tipovi sporulacije:
1. bacilarni-spora manjeg dijametra od ćelije (terminalno,
subterminalno ili centralno postavljena)
2. klostridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (centralno
ili subterminalno postavljena)
3. plektridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (terminalno
postavljena)
Faze sporulacije
Bacilarni, klostridijalni i
plektridijalni tip sporulacije
Bojenje endospora po Schaeffer-
Fulton-u
• zbog specifičnih fizičkih i hemijskih karakteristika
spore teško usvajaju mikrobiološke boje (uočavaju se
kao bezbojne intracelularne tvorevine kod prostog i
bojenja po Gramm-u)
• zagrevanjem preparata zid spore postaje propustljiv
za boju, nepropustljivost zida omogućava da prilikom
obezbojavanja alkohol ne prodire u sporu i ona ostaje
obojena za razliku od drugih vegetativnih oblika
bakterija
Bojenje endospora po Schaeffer-
Fulton-u
• Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja,
pristupa se bojenju preparata
• Procedura bojenja:
1. Bojenje malahitno zelenom bojom (5%) 2min, neophodno je
koristiti filter hartiju
2. Zagrevanje predmetnice na plamenu 3-5min (boja treba da
isparava, ali ne da ključa), kada ispari veći deo boje doda se
nova količina
3. Ukloniti filter hartiju i ispirati vodom
4. Bojenje safraninom 3-5min
5. Ispiranje vodom, sušenje filter hartijom, mikroskopiranje
• Spore se boje zeleno, a vegetativne ćelije crveno
Procedura bojenja endospora
Bojenje acido-alkohol rezistentnih
bakterija po Ziehl-Neelsen-u

• bakterije koje na svojoj površini imaju voštane


materije mogu se lako izdvojiti od drugih bakterija u
razmazu
• one primaju boju, ali se boja ne može isprati pod
dejsvom alkohola i kiselina (acido-alkohol rezistentne)
• bakterije bez voštanih materija na površini gube boju
tokom ispiranja
• acido-alkohol rezistentne bakterije na preparatima
imaju crvenu boju, dok sve ostale imaju plavu boju
• Acido-alkohol rezistentne bakterije: rod
Mycobacterium, rod Nocardia
Procedura bojenja acido-alkohol
rezistentnih bakterija
1. na fiksirani razmaz stavlja se filter hartija preko koje
se naliva boja karbol fuksin
2. predmetnica se blago zagreva iznad plamena tako da boja
isparava, ali da ne ključa (topi se voštana ovojnica i
omogućava prodiranje boje), kada veći deo boje ispari
dodaje se nova količina, postupak se ponavlja u toku 5min
3. ispiranje vodom
4. obezbojavanje smešom etilena i kiseline (HCl ili H2SO4)
20-30sec
5. ispiranje vodom
6. bojenje metilensko plavim 1-3min
7. ispiranje vodom, susenje u filter hartiji, mikroskopiranje
Procedura bojenja acido-alkohol
rezistentnih bakterija
Negativno bojenje
• podrazumeva upotrebu 1 kisele boje
• boji se pozadina oko ćelija kako bi se lakše uočile
veličina, oblik i organizacija celije
• ćelije ostaju ne obojene
• bakteriološki razmaz se ne fiksira toplotom (tačnija
predstava oblika i veličine ćelije)
• primenjuje se prilikom bojenja spirila i spiroheta, koje
običnim postupkom prostog bojenja teže primaju boje
Procedura negativnog bojenja
1. na predmetnicu se stavlja kap nigrozina (tuša)
2. bakterijske ćelije se prebacuju u kap nigrozina (ili
tuša)
3. drugom predmetnicom pravi se razmaz, prevlačeći
je preko predmetnice sa uzorkom pod uglom od 45°,
druga predmetnica se koristi kako bi se napravio
tanak film ćelija
4. razmaz se susi na vazduhu
5. mikroskopiranje
Procedura negativnog bojenja
Preparat-negativno bojenje
Bojenje kapsula
• neke bakterije tokom rasta formiraju kapsulu (glikokaliks)
oko ćelije
• štiti bakterijsku ćeliju od fizičkih i hemijskih faktora
sredine, fagocitoze i predstavlja pomoćnu strukturu
prilikom pripajanja ćelije za površinu u njihovoj sredini
• kapsula-polisaharidna, redje polipeptidna struktura, faktor
patogenosti, uočava se primenom kombinovane tehnike
negativnog i prostog bojenja
• tehnikom negativnog bojenja boji se pozadina primenom
kisele boje (nigrozin, tus, eozin), dok se tehnikom prostog
bojenja boje ćelije
• razmaz se ne fiksira da se ne bi uništila kapsula, pa se ne
preporucuje ispiranje vodom ili se to čini krajnje pažljivo
da se bakterije ne speru
Bojenje kapsula
• da bi se izbegli ovi problemi bakterije se nakon
negativnog bojenja mogu fiksirati sa nekoliko kapi
metil alkohola
• pored ove metode koristi se i metoda bojenja razmaza
kristal violetom (1%) 2min, nakon čega se boja spira
20%-im rastvorom Cu2SO4, obojeni razmaz se ne ispira
vodom, suši se filter hartijom i mikroskopira,
bakterije su obojene tamno ljubičasto, a kapsule
plavičasto
Bojenje kapsula
Primeri prostog i slozenih bojenja