Se utiliza generalmente en una

mezcla bacteriana, por lo que

es preciso separar (aislar)
SIEMBRA POR gérmenes.
AISLAMIENTO

Se pueden obtener colonias

Se requiere de un medio aisladas mediante la ejecución
solido de gran superficie, para de diversas técnicas entre ellas
que al diseminar los tenemos :
microorganismo en el medio
generen su progenie por
formación de colonias
separadas Por
agotamiento Por diluciones
en superficies sucesivas
solidas
 Por agotamiento Por diluciones
en superficies sucesivas
solidas

Utilizando una asa de Se usa la técnica de

kolle (de siembra) vertido de placas

se recoge la muestra e Una serie de diluciones de la

incorpora al muestra es inoculado sobre
medio(inocular) el medio agarificado (un
utilizando la técnica de medio para cada
las estrías. disolución)

Al comienzo de las estrías las

Se debe evitar la obtención de
células crecen estrechamente
placas repletas de colonias
juntas por su desarrollo
(sobrecrecimiento) o sin ninguna
superpuesto, pero a medida que
colonia. Lo optimo es encontrar
se extiende las células son menos
un crecimiento sobre el medio de
y tras su crecimiento originan
30 a 300 colonias
colonias bien separadas.
 o También llamado
SIEMBRA POR TRASPLANTE
repique

Este método se usa para Una cepa microbiana sobre

aislar una colonia de una
población mixta para
obtener un cultivo puro,
dicho cultivo puede ser
solido, liquido o
semisólido.
un medio de cultivo muestra
una actividad metabólica
característica la cual permite
identificarlas

Con la finalidad de
estudiar e identificar a los
microorganismos.
 Materiales y Métodos

Materiales Equipos

Asa de Marcador Placas Baño

Incubadora Autoclave
siembra de vidrio estériles María
 Material Biológico y Medios de
Cultivo

• 3 Tubos c/u con 5 ml de caldo

(liquido)
• 3 Tubos c/u con agar (semisólido)
• 3 Tubos c/u con agar (inclinado)
• 3 Tubos c/u con agar (inclinado en
pico de flauta)
• 1 Placa con agar EMB
• 1 Placa Tripticasa Soya Agar (TSA)
• 4 Frascos con agua de disolución
-Flamear el asa bacteriológica al rojo vivo y enfriar
-Tomar con el asa una pequeña cantidad de muestra del
problema

-En una placa con Agar EMB, distribuir el inoculo en la mayor

extensión posible.Se puede seguir de las siguientes formas:

a) Desde un extremo la superficie del medio haciendo cuidadosamente

estrías en zig-zag con escasa separación entre unas y otras.
b) Habiendo dividido la placa en cuatro cuadrantes, desde un extremo
hasta la parte central.
c)En un extremo depositar el inoculo, homogenizar trazando líneas muy
juntas o 5 líneas paralelas (A).
 flamear el asa a rojo vivo. Enfriar el asa y sin tomar nuevo inoculo hacer una segunda serie
de estrías (B) cruzando un extremo de las anteriores ,repetir dos veces mas esta operación
(C) ,(D) y hacer una estría final dirigida al centro de la placa (E).

-Después de terminar la siembra, esterilizar el asa para evitar contaminación.

-Rotular las placas colocando el nombre del medio de cultivo, el

nombre de la muestra y el grupo de trabajo.
-Colocar invertidas las placas en el incubador a 37 °C por 24 horas.
 -Prepare una serie de diluciones de la
muestra problema
-Transfiera asépticamente 1ml/1 gr. De la muestra
problema y añadirlo a un frasco con agua de dilución
(90 ml) siendo esta dilución 10−1
-extraer 1 ml de la dilución 10−1 a una placa limpia
esterilizada
-del frasco de dilución 10−1 estraer 10 ml a otro frasco
de dilución siendo esta la dilución 10−2 y extraer 1 ml a
una placa limpia esterilizada.
-del frasco 10−2 extraer 10 ml a otro frasco de dilución
siendo esta la disolución 10−3
Hacer lo mismo hasta llegar a la disolución 10−4 de
cada disolución debe haberse sacado 1 ml para
colocarlo en una placa limpia y esterilizada.

-Con la espátula de drigalsky dispersar toda la superficie

del agar de manera homogénea y garantizar el
crecimiento uniforme
-dejar secar un poco y llevar a incubar las placas de
manera invertida a 37 °C por 24 horas
Las colonias crecerán aisladas, de tal manera
que al hacer el conteo se elije la placa que
contega 30-300 colonias adecuadamente
separadas
 Pasos para Realizar una Siembra por
Trasplante

1 2
Primer Paso Segundo Paso
. .

Flamear la asa de siembra sobre En ese mismo instante, con la mano

el mechero, se deja enfriar unos
instantes y levantando la cubierta
de la placa se coge una colonia de
un cultivo bacteriano y se cierra
la placa.
izquierda se coge el medio de cultivo y
con los dedos de la mano derecha sin
soltar el asa se procederá a sacar el
tapón del tubo, flamear la boca del tubo
y proceder la transferencia y taparlo, se
trabajara siempre junto a la llama del
mechero.
3 Formas de Inocular
Tercer Paso
.

Una vez terminada la

En el medio semisólido se
transferencia se quema el asa y
introduce el asa de
se procede a inocular las cepas.
siembra al interior del
tubo y retire por el mismo
lugar (picadura profunda).
En el agar inclinado una
estría en el centro y a lo
largo de la superficie
inclinada ( picadura y
estrías)

En el agar solido inclinado

en pico de flauta En el caldo nutritivo,
introducir el asa en el agitar la aguja inocula
interior del tubo, luego en el medio de cultivo.
trace estrías sobre la parte
inclinada (picadura y
estrías)
• Es necesario recurrir a medios de cultivos para
estudiar en profundidad las características
bacterianas.

• Las técnicas de siembra son necesarios para

poder separar o aislar una mezcla bacteriana y
asi obtener colonias aisladas que permitan el
estudio de estas.

Los repiques son importantes para conocer el

metabolismo, producción de pigmentos o
simplemente conservación de los microorganismos.
Para obtener el crecimiento óptimo de los microorganismos,
no sólo son indispensables los requerimientos nutricionales,
sino otros factores ambientales tanto físicos como químicos.
Un agente físico es una condición física o propiedad física
que causa un cambio, por ejemplo la humedad, la
temperatura, la presión osmótica, el pH, las radiaciones y los
filtros bacteriológicos. El crecimiento de los microorganismos
se modifica o se limita al cambiar los factores ambientales
físicos en el medio. El conocimiento de los factores
ambientales nos permite explicar la distribución de los
organismos en la naturaleza, sobre todo en el caso de
organismos que son patógenos, que causan deterioro en los
alimentos o que dan lugar a pérdidas económicas en otras
formas. El manejo de estos factores se puede utilizar para el
control del crecimiento microbiano.
Muchos microorganismos necesitan además factores y sustancia que estimulen su crecimiento

Solución nutritiva sencilla Suplemento vitaminico

KH2PO4 0,5gr biotina 0,2mg
NH4Cl 1gr Ac. Nicotinico 2mg
MgSO4 7H2O 0,2gr tiamina 1mg
FeSO4 7H2O O,01gr Ac. P- 1mg
aminobenzanico
CaCl2 0,01gr Piridoxina 50mg
Glucosa 10gr Cianocobalamina 2mg
Agua 1lt

Crecimiento Siembra Colonia Cepa

microbiano microbiana
 objetivos Mediante la aplicación de técnicas
de siembra debe poder obtener
colonias aisladas a partir de
poblaciones mixtas

El alumno debe poder Que adquiera la habilidad de

ejecutar adecuadamente las realizar transplantes de cultivos
técnicas diversas de siembra en medios líquidos, sólidos y
semi-sólidos

Que sea capaz de elegir la técnica

mas adecuada de acuerdo al tipo
de muestra y el propósito de siembra
 Crecimiento en
Tipo de
medio líquido
colonias
semisólido y sólido
en agar
Desarrollo
en agar
inclinado y
semi-
Una de las principales
inclinado
características de las
bacterias es su Desarrollo
apariencia de de caldo
crecimiento sobre los
diferentes medios de
cultivo y las
modificaciones q pueda Desarrollo en
realizar además ayudan medio
a su diferenciación y semisólido por
clasificación taxonómica picadura
adecuada
Colonias en
placas con Forma
agar

Tamaño

Margen o borde

Elevación

Superficie

Características
Cromogénesis ópticas
 DESARROLLO EN AGAR
INCLINADO
Cuando el tipo de siembra es por estrías en
superficie sobre el agar inclinado en tubo
,podemos observar:
a) CANTIDAD:escaso,moderado o abundante.
b) MARGEN: desarrollo uniforme o incluso
presentando varias irregularidades
(filiforme,equinulado,erizado,difuso,rizoide)
c) CONSISTENCIA: La masa que desarrolla
puede presentar consistencia mantecosa,
fácilmente removible, con una aguja de
siembra ,viscosa y filamentosa, seca y
brillante.
d) CROMOGENESIS:similar a la descrita para las
colonias.
 DESARROLLO EN MEDIO
SEMI-SOLIDO
Cuando el tipo de siembra es por picadura
profunda en el interior del medio de cultivo
contenido en el tubo podemos observar:
a) DESARROLLO LIMITADO: cuando el
desarrollo se limita a la zona de la
picadura solamente(filiforme),se
trata de un microorganismo que
carece de movimiento.
b) DESARROLLO EXPANDIDO: cuando el
desarrollo se expande mas allá de
la picadura ,se trata de un
microorganismo móvil. Puede ser
papiloso ,velloso o arborescente.
DESARROLLO EN
CALDO NUTRITIVO
a) CANTIDAD:escaso,moderado o
abundante.
b) DISTRIBUCIÓN: desarrollo puede
ser uniforme (turbidez),en la
superficie del caldo como nata o
pelusa (pelicula),o aquel que se
acumula como sedimento que es
granular o viscoso(sedimento).
c) OLOR: pútrido, a frutas o
aromático ,o imperceptible.
 II.OBJETIVOS

 Que los estudiantes conozcan y puedan identificar las

principales características macroscópicas y microscópicas
de colonias bacterianas.
 Que los alumnos puedan relacionar convenientemente las
características de la colonia con el tipo de microorganismo.
KLEBSIELLA SP EN AGAR MAC • STAPHYLOCOCCUS SP.
CONKEY
• colonias medianas,
 colonias grandes convexas, de color blanco,
planoconvexa, mucoides,
brillantes, forma irregular, forma circular, bordes
también se redondeados
observan redondeadas, bordes
ondulados,

staphylococcus aureus
colonias rosas, mucoides, bordes irregulares, en agar sangre
convexas medio de cultivo Mac conkey
 BACILLUS SP.
 colonias medianas, convexas,
blanquecinas como cera, forma
fusiforme y circular, bordes redondeados.
colonias de bacillus sp
en agar nutritivo
ESCHERICHIA COLI
 medio de cultivo es agar eosina azul
de metileno.
 se logran ver colonias aisladas, son
colonias medianas, circulares,
convexas, moradas, contorno verde
metálico, bordes redondeados
color verde metálico en las colonias
característico de escherichia coli en
medio de cultivo EMB
 CRECIMIENTO MICROBIANO EN
MEDIO LÍQUIDO
 Si la bacteria crece en un medio líquido,
en la mayoría de los casos las células
que se producen en cada división
forman una suspensión de células libres.
MICROBIANO EN MEDIO
SÓLICRECIMIENTODO
 La cinética de crecimiento, en este
caso, se puede estudiar siguiendo la
evolución del número de células
viables por unidad de superficie o por
unidad de masa. Cuando una célula
aislada e inmóvil comienza a crecer
sobre un substrato sólido, el resultado
del crecimiento al cabo del tiempo es
una colonia. Por consiguiente, se
denomina unidad formadora de
colonia (UFC) a una célula bacteriana
viva
1. ¿Por qué es importante las técnicas de siembra?

Las técnicas de siembra son importantes para efectuar el estudio de microorganismos

por diversas técnicas que permiten cultivar bajo condiciones artificiales y a su vez
experimentar y manejar uno o varios tipos de microorganismos .
Es importante para la separación de las células que van a dar lugar a colonias aisladas
y asi facilitar el estudio cualitativo o cuantitativo de estas. Y también cuando nos
encontremos con una mezcla microbiana por lo que es necesario separar o aislar los
gérmenes.
 Si Ud. Tiene una muestra de agua tierra, y se requiere de un estudio
cualitativo y cuantitativo. ¿Qué método de siembra aplicaría para
2. cada estudio- Explique por qué? Haga un esquema tentativo de su
metodología en cada caso.

Para el análisis cualitativo elijaría la siembra
por agotamiento, porque en esta técnica
podemos observar y diferenciar colonias de
microorganismos fácilmente.
Para el análisis cuantitativo escogería la técnica
de cultivo por diluciones, porque esta técnica nos
permite observar y contabilizar las colonias así
como observar también características
cuantitativas
 De acuerdo a lo observado se puede decir que que todos los
microorganismos presentan las mismas características de
3. crecimiento tanto en placas como en tubos. ¿por qué?

El procedimiento que se usa para la siembra de estos

microorganismos son parecidos en cada caso además que
la preparación de los medios no difiere mucho, además
depende también del cuidado que se tuvo al preparar el
medio y a la correcta siembra de los microorganismos.
 ¿COMO USTED EVALUARÍA SI LOS MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO ESTÁN EN PERFECTAS
4. CONDICIONES Y ASÍ ASEGURAR UN BUEN RESULTADO?

• ESTERILIZACIÓN :proceso el cual se eliminan todas las formas de vida de los microorganismos de
un objeto o de una sustancia para evitar su reproducción.
MÉTODOS QUÍMICOS:
a) Hipoclorito de sodio: Es utilizado para la desinfección, destruye todos los microorganismos
incluso virus.
b) Aldehidos:actua como un esterilizante frio.
c) Alcohol: esteriliza superficies.
MÉTODOS FÍSICOS:
• AUTOCLAVE: se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo mas usado es
el de chamberland.esteriliza a 121°c ,15Lb de presión por 20 minutos.
• CALOR HÚMEDO: Esterilizar exclusivamente en calor húmedo: medios de cultivos, recipientes
contaminados, material de goma, y todo elemento que no resista las altas temperaturas del
calor seco.
• CALOR SECO: Deshidrata las bacterias, virus, etc. y facilita la coagulación o desnaturalización de
las proteínas. Se requieren mayores temperaturas para producir daño irreversible (muerte).
Es un proceso por el cual las
moléculas de un colorante se
absorben a una superficie. El uso de
colorantes permite cambiar el color
de las células de los
microorganismos y poder realizar la
observación en el microscopio.
Permite examinar a los microorganismos en condiciones de vida normal
suspendidos en un liquido, es recomendado usar:
 Cuando se trate de microorganismos espiralados, ya que la tinción altera
su forma.
 Para saber si el microorganismo es móvil.
 Para observar los cambios citológicos durante la división celular.
 Determinar la presencia de vacuolas y materias grasas.
Son las usuales para observar las características morfológicas de las bacterias. Sus
ventajas son:
 Las células son visibles con mayor claridad.
 En las preparaciones teñidas entre células de especies diferentes y misma
especie se demuestran mediante soluciones colorantes.
Pasos:
 El frotis
 La fijación
 La aplicación de una o mas soluciones colorantes.
Para teñir los microorganismos se tiene en cuenta la estructura molecular de los
colorantes de acuerdo a esto se pueden clasificar en colorantes de
trifenilmetano, oxanina y tiacina. Y lo mas practico es de acuerdo al
comportamiento químico del colorante.
+ Aplicación de un solo colorante (azul de
metileno, fucsina, etc)

PROCEDIMIENTO:
1. Seleccionar una colonia aislada. Un cultivo puro en caldo
de cultivo.
2. Extensión: retirar una porción de la colonia, colocar sobre
una lamina y homogeneizar, obteniendo una película.
3. Fijación :pasar la preparación sobre fuego suave con el fin
de fijar la muestra a la lámina
4. Coloración: inundar la muestra extendida y fijada con el
colorante azul metileno. Dejar 1 min.
5. Lavado y secado: descartar el colorante dejar secar a
temperatura ambiente.
 BACTERIAS GRAM POSITIVAS:
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:

ORDEN DE SOLUCIONES BACTERIAS GRAM BACTERIAS GRAM

APLICADAS POSITIVAS NEGATIVAS

1. CRISTAL VIOLETA Teñidas de violeta Teñidas de violeta

2. SOLUCION YODO- Permanecen violeta Permanecen violeta

YODURADA
3. DECOLORANTE Las paredes celulares Extraccion de lipidos de
(alcohol cetona ) se deshidratan, las paredes celulares.
disminuye la Quedan incoloras.
permeabilidad.
Permanece violeta
Colorante de contraste( Las bacterias no Las bacterias toman el
safranina, o fucsina afectadas colorante y aparecen
fenicada) permanecen violeta rojo.
 Para microorganismos que
difícilmente se colorean
 Es necesario someterlos a calor
para disolver la parte lipídica de
su pared, ingreso al citoplasma
celular.
 Luego se deja enfriar dejando
reordenar su pared celular
reteniendo el colorante y
resistiendo a la decoloración del
alcohol ácido
 FAMILIA MYCOBACTERIACEAE
 Para su preparación se vierte una gota del liquido que contiene
los organismos en una lamina portaobjetos.
 Se cubre con el cubreobjetos; para disminuir el ritmo de la
evaporación.
 La preparación debe bordarse con parafina o otra sustancia
similar y sellar el espacio entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
1. Proceder como en la coloración simple hasta el paso
c
2. CRISTAL VIOLETA: Añadir el colorante a la muestra,
dejar actuar por 1 min
3. MORDIENTE: Inundar la preparación con la solución
Lugol . Deja por 3min. Lavar y escurrir el exceso de
agua:
4. Inundar con el colorante safranina. Dejar actuar por
30 seg.
5. Secar a temperatura ambiente y observar en
microscopio
1. explique:
¿Cuál es la importancia de aplicación de las coloraciones en
microbiología?
Gracias a ellas se facilita la observación de los microorganismos en el
microscopio ya que en la mayoría de las ocasiones son incoloros y en el
empleo de cada una de las coloraciones es de acuerdo a lo que se
quiere observar ya sea morfología, agrupación, una estructura en
particular e incluso diferenciar a bacterias por sus características
morfológicas.

¿Qué grupos de bacterias se identifico en las laminas fijadas con

la coloración Gram?
Se pueden distinguir los cocos (estabilococos), bacilos,
cocobacilos, los vibriones los espirilos
2. ¿Qué función cumple el Lugol, la Safranina y el alcohol
Acetona en la coloración Gram?
 Lugol: es un compuesto formado por yodo en equilibrio con
yoduro de potasio y Silverio, los cuales están presente para
solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el
cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de
la célula bacteriana.
 Safranina: proporciona un color violeta mas intenso a las
bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias Gram-,
también se usa como liquido de contraste en algunas
coloraciones.
 Alcohol Acetona: sirve para realizar la decoloración, ya que
en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los
organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los
gram negativos sí lo hacen.
 3.- Diga cual es la importancia del uso de las coloraciones Gram y
Zielh Nielsen
Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram. Basándose en
su reacción a la tinción Gram, las bacterías pueden dividirse en dos
grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene gran
importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción
diferencial rápida y económica, usada para la identificación de
bacterias ácido-alcohol resistentes

 4.- Cual es el fundamento de coloración Gram y la coloración

Zielh Nielsen.
Fundamento. cantidades de etanol a las células teñidas con cristal
violeta. células de color rosa (bacterias de pared Gram negativa).
La pared de Gram negativas debe su rigidez a una capa de mureína
mas delgada, a través de la cual el alcohol extrae el cristal violeta
de estas células.
 5.-cual es la importancia de la coloración simple, que otros
colorantes puede utilizarse y en que casos?

Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram. Basándose

en su reacción a la tinción Gram, las bacterías pueden dividirse
en dos grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene
gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica
diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias.