SEMINARIOS BIOQUÍMICA I

• Cromatografía

• ELECTROFORESIS

• ADN Recombinante

http://minnie.uab.es/~veteri/21206/S.II_electroforesis_09.ppt
 INTRODUCCIÓN Arne Tiselius
1937
ELECTROFORESIS (Nobel 1948)
Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN

... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico

(dependerá de su carga eléctrica)
cátodo ánodo * Moléc. (+)  polo (-) o cátodo
* Moléc. (-)  polo (+) o ánodo

ELECTROFORESIS LIBRE
 moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva

SOPORTE ánodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
 SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución

cátodo
 EQUIPO ELECTROFORÉTICO
fuente de cable Componentes:
alimentación

cátodo ánodo * Fuente de alimentación

- muestra +
electrodo
electrodo gel
* Dos electrodos
ánodo (+)
cátodo (-)
(E. horizontal)
cubeta tampón

electrodo muestra * Cubeta

cátodo
-
* Tampón de electroforesis

cubeta * Soporte electroforético

cable
(gel)
ánodo gel
+
fuente de
alimentación

(E. vertical)
tampón
 FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón
electroforesis
*Temperatura: efecto Joule  refrigerantes

2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más

3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléculas (-)
*Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera

4_ Soporte
 SOPORTE ELECTROFORÉTICO
Características

 Gel poroso (entramado tridimensional interno)

 Tiene que permitir el paso de moléculas
 Material inerte: NO puede estar cargado y no
debe adsorber las moléculas de la muestra
Gel poroso
Tipos de Soporte

 No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento

a su paso  separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón,
agar

 Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su

paso  separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida
 EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa

Electroforesis horizontal
muestra
Strip

+ Avance de las proteínas -

Campo eléctrico (V)

1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría

Aplicaciones diagnósticas en serología

(separación proteínas séricas)
EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA

Feline: Feline Feline: Lymphosarcoma

Infectious Peritonitis

Canine: Leishmaniosis

Equine: Chronic Equine: Inmunodeficiency

Hepatitis + Pneumonia
 EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida

* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida

* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
[poliacrilamida] tamaño poro

Electroforesis vertical

1. Preparación del gel

2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Sales de plata
 EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Ventajas:

* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO

* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

Aplicaciones:

* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
* Separar proteínas oligoméricas

* Separar proteínas en función de su pI Isoelectroenfoque

* Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2D

* Ver si hay una proteína en concreto Western Blot

 SDS-PAGE
Condiciones de la PAGE:

* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE

* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE

Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, -mercaptoetanol)...

• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
 todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño

- - - -
-
+ SDS - -- - -
- - - - - - - --- - --
- S-S - S-S - - - -
44 kDa
- - S-S -- -
S-S
S-S
S-S

PM = 50 kDa
+ SDS
+ DTT - --- - - -
- - - - - - --- - 25 kDa
SDS-PAGE: determinación del peso molecular

Marcadores de peso molecular:

* Mezcla de diferentes proteínas

pre-teñidas de las que conocemos el
peso molecular.

* Por comparación podemos averiguar

el PM de nuestra proteína.
 ISOELECTROENFOQUE
* Separación de proteínas según su punto isoeléctrico (pI)

pI es el valor de pH en el que la carga de la proteína = 0

si pH > pI: carga (–)
si pH < pI: carga (+)

* Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH.

+ + + Proteínas migran hasta

pH 2 A B
(ácido)
la zona del gel donde
+ + pH=pI de la proteína
GRADIENTE DE pH

A B A
0 + 0 pH 6
B Prot A pI=6
0 pH 7 Prot B pI=7

pH 10
(básico)
- - -
 ELECTROFORESIS 2D

* 1ª dimensión: ISOELECTROENFOQUE  separa por pI

* 2ª dimensión: SDS-PAGE  separa por PM

1ª DIMENSIÓN 2ª DIMENSIÓN
ELECTROFORESIS 2D
 WESTERN BLOT
* Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible)
1. SDS-PAGE Electroforesis

2. Transferencia a membrana 3. Incubación con los Anticuerpos

proteínas proteínas
2dario
proteína
HRP interés
1ario

Resultado
SDS-PAGE Western BLOT
4. Revelado
SUSTRATO
proteína
HRP
interés PRODUCTO LUZ

Todas las Proteína

proteínas de interés
 WESTERN BLOT
* Técnica immunológica  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible).

SDS-PAGE:

Resultado
SDS-PAGE Western BLOT

WESTERN BLOT:

Todas las Proteína

proteínas de interés
 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Soporte: (restrictivo)

* Gel de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)

* Gel de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)

Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)

Separación sólo por TAMAÑO

Densidad de carga igual para todas las

moléculas por los grupos fosfato

Ácidos nucleicos = carga (-)

 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Aplicaciones:

* Separar, identificar y purificar fragmentos

de DNA o RNA
* Determinar tamaño de un fragmento de DNA Gel de agarosa
* Separación de cromosomas enteros

* Secuenciación de DNA
* Identificación de regiones de unión a Gel de poliacrilamida
proteínas

* Detectar la presencia de un gen (o secuencia

Southern Blot
específica de DNA) en una muestra

* Determinar si se expresa un gen específico Northern Blot

 EN GEL DE AGAROSA

Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa

Electroforesis horizontal

muestra (-)

+ -

Campo eléctrico (V)

1. Preparación del gel

2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
 EN GEL DE AGAROSA

Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa

Electroforesis horizontal

muestra (-)

+ -

Campo eléctrico (V)

1. Preparación del gel

2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
 SOUTHERN BLOT
* Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena)
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA
moléculas de DNA
32
P
de DNA …TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
4. Revelado

DNA
interés
32
P

Todos los DNA

DNA de interés
 NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA
moléculas de RNA
32
P
de RNA …TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés

Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado

RNA
interés
32
P

Todos los RNA

RNA de interés
 Links a simulaciones de electroforesis:

- En tira de acetato de celulosa:

http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio.htm

- En gel de poliacrilamida

http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm

- En gel de agarosa:

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.swf

http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html