UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA.
TRABAJO COLABORATIVO 2

PRESENTADO POR:
CAMILO ANDRES CANIZALEZ
GERARDO HORACIO FAJARDO
LUIS ANGEL FLOREZ
RUDI ANDRES LASSO
ALVARO ANDRES RIVERA WALTEROS.
COD: 1.105787.342
Grupo
211619_4

PRESENTADO A:
GIOVANNI RUEDA

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA

MARZO 2017
LA PURIFICACIÓN,
CARACTERIZACIÓN Y LA
CINÉTICA DE INHIBIDOR DE LA
PROTEASA DE LAS FRUTAS
DE SOLANUM
ACULEATISSIMUM JACQ
 PROCESO DE PURIFICACION, CARACTERIZACION Y CINETICA DEL INHIBIDOR DE LA PROTEASA DE FRUTOS DE
SOLANUM ACULEATISSIMUM

Consiste en

v v

v
v

Modificación
Purificación de Ensayo de la SDS y enfoque Efecto de la Efecto de iones química de
SAPI actividad de temperatura y el Análisis cinético metálicos, Dicroísmo
isoeléctrico residuos de
inhibidor de la pH detergentes circular
aminoácidos de
proteasa agentes SAPI
oxidantes y
Se realiza Confirmación reductores de la
Se determina Masa molecular conocer Se utiliza actividad PI Por medio de
mediante
cromatografía de v
Mediante la tamaño de elución
estimulacion de la Mediante protocolo utilización
Efecto de la de análisis grafico de Equipo de espectro
actividad hidrolitica temperatura sobre la polarímetro para
residual de la tripsina Dixon
Homogenización triptosina o actividad analizar las
de muestra en y la quimotripsina donde para inhibidora de características
solución salina hacia el BAPNA quimiotripsina estructurales nativas
sustratos,pH 8.0
Se somete a De agentes de lavado
y agentes oxidantes
La medición del durante 30 min para
Se hace Tampon con TRIS, contenido proteico
Se evalua calcular las siguiendo
La separacion de
filtrado,centrifugado por método actividades
proteinas se utiliza
Brandford, utilizando electroforesis 2D inhibidoras
BSA por tinción azul
coomassie Metodología de
Precipitación de Leach y Fish
proteínas con Por incubacion de observando eliptica
En baño de agua fría SAPI durante 30 min molar, estructuras
(NH4)2SO4 agitación con sulfato a baño maria 10- secundarias usando
de amonio a 100°C programa K2D
consiste diferentes Consiste en
concentraciones de
Siguiente paso o-20 a 90
Para medir Intervienen
Adicion de sal
lentamente y agitacion realizar Agitación continua
durante 5 a 10 min 10-30 min, solución
resultante Separacion por Estabilidad del pH
centrifugar Proteína dializada en con tampones
cargas, proteinas Modificadores
columna de básicos para probar
separadas por su químicos específicos
Se procede a intercambiador de actividad inhibidora
peso molecular con para analizar los
celulosa, de tripsina y
el gradiente de pH en aminoácidos activos
Sulfato de amonio concentración de quimotripsina
Decantar y el condiciones de la molécula
por proceso de SAPI en columna de
precipitado se desnaturalizantes de inhibidor
resuspende en 1-2 retirar dialisis afinidad sepharose y
acuerdo a su punto
comprobación de la
volumenes isoelectrico
pureza.
someter
Se han aislado diversos tipos de inhibidores de
proteasa (IP), caracterizado, y evaluado por sus
potenciales biológicos. Ellos son péptidos de peso
molecular pequeñas capaces de inhibir proteasas
endógenas.

 El inhibidor se purificó hasta la homogeneidad a través de cuatro procedimiento de

etapas secuenciales, es decir, precipitación de la sal a Sepharose cromatografía de
afinidad. La pureza se confirmó por cromatografía de HPLC de fase inversa. La masa
molecular se detectó utilizando cromatografía de tamaño de elución (22,2 kDa).
 MATERIAL Y MÉTODOS

 De sulfato de amonio proteínas precipitado baja concentración con las

regiones menos hidrófilo. Mientras tanto proteínas con regiones más
hidrófilas se concentran y se precipitan con mayor
(NH 4 ) 2 SO 4 saturación. El vaso de precipitados que contiene 100 ml de
solución de proteína se colocó en un baño de agua de refrigeración en la
parte superior de una placa de agitación magnética. Esto se logra
colocando el vaso de precipitados dentro de otro vaso de precipitados
que contiene la suspensión de agua-hielo. (NH 4 ) 2 SO 4 precipitación se
lleva a cabo a diferente saturación como 0-20, 20-40, 40-60, 60-80 y 80-90%
mediante la adición de 5,35, 11,45, 36,6, 52,3 y 61,7 g de sal lentamente y
agitación suave en un agitador magnético, respectivamente. Este paso se
completó en 5-10 min.
 ENSAYO DE ACTIVIDAD DE INHIBIDOR DE LA
PROTEASA

 En pH 8,0 después de la pre-incubación con inhibidor de [9] . Una unidad de tripsina o

quimotripsina se conoce como 1 mol de sustrato hidrolizado por min de reacción. Una
unidad inhibidor se registró como la cantidad de inhibidor necesaria para inhibir el 50%
de la actividad de la enzima correspondiente.
 SDS, NATIVO-PAGE Y ENFOQUE
ISOELÉCTRICO
 La masa molecular se confirmó adicionalmente mediante cromatografía de tamaño de
elución. En electroforesis en 2-D, IEF se realizó con placas de gel de poliacrilamida
Ampholine de Pharmacia (rango de pH 3-11) junto con Pharmacia p-gama amplia I kit
de calibración que contiene proteínas con diferentes puntos isoeléctricos que van de 3 a
10.
 EFECTO DE LA TEMPERATURA Y PH

 El efecto de la temperatura sobre la tripsina o actividad inhibidora de quimotripsina se

evaluó por incubación de SAPI durante 30 min en baño de agua a intervalo de
temperatura de 10-100 ° C, y después se enfrió antes de la prueba para la actividad
inhibidora residual.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

etapas de La proteína
precipitación total (mg / g de La actividad específica (/ mg de
(%) La actividad total (U / g de tejido) Rendimiento (%) tejido) proteína U) Fold de purificación

T Connecticut T Connecticut T Connecticut T Connecticut

0-20 4725 4562 97. 2 97 874 5.40 5.22 0.99 0.97

20-40 3812 4000 78.3 85 720 5.29 5.5 0.97 1.05

40-60 3466 3616 71.2 76.9 629 5.51 5.74 1.01 1.09

60-80 3115 3209 64 68.3 523 5.95 6.13 1.09 1.17

80-90 2960 2895 60.8 61.6 367 8.07 7.89 1.49 1.51
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La proteína
Las etapas de total (mg / g La actividad específica (/ mg de
purificación La actividad total (U / g de tejido) Rendimiento (%) de tejido) proteína U) Fold de purificación
T Connecticut T Connecticut T Connecticut T Connecticut
inhibidor de 4865 4698 100 100 898 5.42 5.23 1 1
crudo
El sulfato de 2960 2895 60.8 61.6 367 8.07 7.89 1.49 1.51
amonio 90%
intercambio 1528 1479 31.4 31.5 16.4 93.2 90.2 17.1 17.24
iónico de
celulosa DEAE
Sephadex G-50 657 623 13.5 13.3 2.3 285,7 270,9 52.7 51.8
sefarosa 477 412 9.8 8.77 0.95 502 433,7 92.6 82.9
 LA MASA MOLECULAR Y LA
EVALUACIÓN ISOINHIBITOR
 SDS-PAGE separación electroforética de SAPI mostró una única banda prominente de
22,2 kDa de masa. De acuerdo, el tamaño de cromatografía de elución también reveló
la misma masa.
 INHIBIDOR DE LA CINÉTICA Y LA
CONSTANTE
 relación inhibidora Molar de SAPI frente a tripsina y quimotripsina a ser similares. Los
gráficos de inhibición aumentaron constantemente hasta un 85% y la extrapolación lineal
posteriores revelaron complejo 1: (1 tripsina / quimotripsina-SAPI ).
 LOS ESTUDIOS DE ESTABILIDAD
 En los estudios de sensibilidad a la temperatura, la tripsina y quimotripsina actividades
inhibidoras relacionados con SAPI se ensayó a temperatura que oscila de 10 a 100 °
C. Actividades inhibidoras residuales se conservan notablemente hasta 70 ° C lo que sugiere su
naturaleza estabilidad térmica.

Temperatura (° C) % De la actividad inhibidora residual pH % De la actividad inhibidora residual

TI CI TI CI
10 23 17 2 23 17
20 71 63 3 55 50
30 97 90 4 63 56
40 97 93 5 78 67
50 95 95 6 88 76
60 92 88 7 98 90
70 88 82 8 100 94
80 74 69 9 82 69
90 40 25 10 68 59
100 21 15 11 56 45
12 44 32
 EFECTO DE IONES METÁLICOS, DETERGENTES, AGENTES
OXIDANTES Y REDUCTORES SOBRE LA ACTIVIDAD DE
INHIBIDOR DE LA PROTEASA
 El papel de cationes monovalentes y bivalentes se evaluó por incubación de SAPI con
iones 1, 5, 10 y 20% de metal.

proteasa Tripsina% de la actividad inhibidora residual La quimotripsina% de la actividad inhibidora residual

Concentracione
s (mmol / L): 1 5 10 20 1 5 10 20
Los iones metálicos
Sodio 33.5 36.2 38.4 28.3 0.2 3.4 30 25
Calcio 60 50.7 48.2 45.5 88 92 75 60.8
Magnesio 65.2 56 50 45.4 77 80.6 66 50
cúprico 110 123 100 88.4 100 112 95 76
férrico 109,5 116 76.5 70.9 95 110 80 sesenta y cinco
Níquel 35.7 30.8 27.3 22.1 39 34 23 18
Cadmio dieciséis 17 12 9 17 12 8 2
Aluminio 40.4 34.5 27.6 22 36 30 28 11
Manganeso 124 133 100 92 126 137 98 94
Zinc 138 133 110 101 142 145 122 99.1
mercúrico 109 100 98 95 98 105 90 81
Dirigir 15 10 7 4 19 11 6 2
 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE SAPI POR DICROÍSMO
CIRCULAR (CD)

 La estructura secundaria y terciaria

de SAPI revelado por CD Spectra
en 190-250 y 250-300 nm se
analizaron a pH 7,5. Curiosamente,
65% β -pleated, 14% espiral α hélice
y el 20% de espiral al azar se notan.
 CONCLUSIÓN

 Este trabajo desvela el PI de los frutos de S. aculeatissimum que inhibe la tripsina y la

quimotripsina en una relación molar 1: 1. SAPI exhiben una notable estabilidad a
temperatura y amplia gama de pH. CD análisis espectral reveló la presencia de
estructura secundaria y espirales aleatorias. Estudios de modificación química indican
que la lisina y el triptófano en el sitio reactivo de PI que desempeñan papel clave en el
mecanismo de inhibición de la proteasa.