Orientador docente: Emerson Pontes

Aluno de doutorado: Leonardo Terra

Aulas: DNA, RNA e Proteínas

 A ESTRUTURA E A
REPLICAÇÃO DO DNA
Processo que precede a divisão celular e através
do qual são geradas cópias idênticas das
moléculas de DNA presentes na célula-mãe, a
seguir herdadas pelas duas células-filhas.
Divisão celular em células
eucarióticas
G1= células diplóides
S = período de síntese Fonte: https://www.nature.com/scitable/topicpage/eukaryotes-and-cell-cycle-14046014

G2 = divisão do núcleo
M = divisão da célula
Empacotamento do DNA dentro
do cromossomo
 James Watson e Francis Crick
• Mostraram que a estrutura do DNA é uma
dupla hélice
“Não escapou a nossa atenção que
o pareamento específico ora
proposto por nós sugere
imediatamente um possível
mecanismo de cópia do material
genético”
Watson & Crick, Nature, 1953

A replicação do DNA é
semiconservativa, pois
cada dupla fita filha
contém um filamento
parental e um recém-
sintetizado
DNA Duplicação DNA DNA
Replicação Ácido Desoxirribonucleico

Transcrição

Ácido Ribonucleico

Tradução

Proteína
 Replicon
Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

• Origem + Término
• Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
• O genoma de uma célula procariótica possui único replicon
• Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e todos são ativados
uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
 O genoma eucariótico possui vários replicons

• A velocidade da forquilha de
replicação é 2.000 pb/min.
• Os replicons eucarióticos tem 40
– 100 kb e são iniciados em
tempos diferentes.
• Fase S do ciclo celular demora
aproximadamente 6 hrs em uma
célula somática.
 ESTRUTURA DO DNA
Nucleotídeos
• fosfato
• desoxirribose
• base nitrogenada

Quando o grupo fosfato não está presente, a base e a desoxirribose

formam um nucleosídeo.
Nucleotídeos são as unidades
monoméricas de ácidos nucleicos

γ β α

H
 Cada hélice é uma
cadeia de
nucleotídeos ligados
por uniões
fosfodiéster
 BASES NITROGENADAS
Purinas (Adenina e Guanina)
Pirimidinas (Citosina e Timina)
 Bases nitrogenadas

Principais bases do RNA: ... e do DNA: A, C, G e T

A, C, G e U

Pirimidinas:

Pirimidina Uracila Timina Citosina

Purinas:

Purina Adenina Guanina

A quantidade total de nucleotídeos pirimidínicos (T
e C) é sempre igual a quantidade total de
nucleotídeos purínicos (A e G)
• T=A
• C=G

As bases interagem por

ligação de hidrogênio
DESNATURAÇÃO DO DNA
T m (temperatura de melting) depende do comprimento da molécula de DNA e
da sua sequência de nucleótideos específica.
 Thermophilus aquaticus

Como esta bactéria

consegue sobreviver
entre 50º a 80º C sem
desnaturar o DNA?
Yellow Stone National Park, USA
 ETAPAS DA REPLICAÇÃO

1. ETAPA DE INICIAÇÃO (controlo da replicação)

• Reconhecimento das origens de replicação por um
complexo proteico
• Abertura localizada da dupla cadeia de DNA pela
DNA helicase
• Síntese do primer

2. ETAPA DE ELONGAÇÃO
• Síntese contínua na cadeia leading
• Síntese descontínua na cadeia lagging

3. ETAPA DE TERMINAÇÃO
• Reconhecimento de sequências, sobre as quais se
fixam proteínas, bloqueando o movimento de
progressão da forquilha de replicação
 Síntese de DNA ocorre sempre na direção 5’ 3’

OH livre é muito
importante para o
alongamento da fita

Não ocorre na natureza!!!

 REPLICAÇÃO EM E. COLI
REPLISSOMA – COMPLEXO DE ENZIMAS E PROTEÍNAS NECESSÁRIOS A
REPLICAÇÃO

POLIMERASES
 HELICASES
 TOPOISOMERASES
 PROTEÍNA DE LIGAÇÃO AO DNA
 PRIMASE
 LIGASE
 Mecanismos de replicação
Direção de síntese
A enzima helicase
desenrola e abre a dupla-
hélice

Fita
descontínua

Fita contínua

A enzima topoisomerase
desenrola a dupla-hélice
e alívia a tensão.
 Mecanismos de replicação
Direção de síntese

Fita
descontínua

Fita contínua
 Mecanismos de replicação
Direção de síntese

Fita
descontínua

A DNA
polimerase
alonga a Fita contínua
fita

A DNA
polimerase
alonga a
fita
Síntese de DNA ocorre sempre na direção 5’ 3’

Fita com síntese contínua

Fita com síntese descontínua

Fragmentos de Okasaki: Bactéria 1.000 a 2.000 pb

Eucariotos 150 a 200 pb
 Síntese da cadeia de DNA envolve a formação de ligações covalentes

Mg+2
(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi
polimerase

Legendas:
dNMP: desoxi nucleosídeo monofosfato
dNTP: desoxi nucleosídeo trifosfato
PPi: Pirofosfato
 DNA é sintetizado por DNA
polimerases
• DNA polimerase I foi isolada a partir de E. coli
em 1955 por A. Kornberg.
• As DNA polimerases necessitam sempre de um
DNA molde e uma sequencia iniciadora.
• O substrato da síntese é o
desoxirribonucleotídeo trifosfato.
• A síntese de DNA ocorre pela adição de
nucleotídeos a extremidade 3’OH da cadeia em
crescimento.
• Sentido da síntese sempre é 5’ 3’.
 PROPRIEDADES DA DNA POLIMERASE

• ATIVIDADE POLIMERÁSICA 5’ 3’
• NECESSIDADE DE UM MOLDE
A cadeia molde complementar é copiada no sentido 3’ 5’

• NECESSIDADE DE UM PRIMER
• ATIVIDADE EXONUCLEÁSICA 3’ 5’ E 5’ 3’
• PROCESSIVIDADE
Número de nucleótidos adicionados antes que a enzima se dissocie
do molde. Esta propriedade pode ser potenciada por proteínas
associadas.
Processividade da DNA polimerase
Processividade da DNA polimerase
DESOXIRIBONUCLEOSIDEO 5’ TRIFOSFATO

H
H3C

H
H
H
H

desoxiAdenosina desoxiGuanosina desoxiTimidina desoxiCitidina

5’ Trifosfato 5’ Trifosfato 5’ Trifosfato 5’ Trifosfato
Atividade revisora (atividade
exonuclease 3’ 5’) garante a
fidelidade da replicação
 PRIMER – marca o inicio da replicação

• Um curto oligonucleotídeo que gera um

segmento de DNA dupla fita.
• Os primers são sintetizados pela RNA
polimerase ou por uma enzima primase.
• Tamanho médio do primer – 30 pares de
bases
 Mecanismos de replicação
Direção de síntese

Fita
descontínua

Fita contínua
U
Remoção de iniciadores de RNA pela DNA polimerase I (atividade 5’3’ exonuclease)
Ligação do ponto de quebra pela DNA ligase

(Corte)
 (Corte)

ATIVIDADE 5’ 3’
EXONUCLEÁSICA
E POLIMERÁSICA DA DNA
POLIMERASE I
 Mecanismo da reação catalisada pela DNA ligase

(Corte)
Fitas complementares
 Nucleases

= enzimas (hidrolases) que clivam ligações

fosfodiéster de ácidos nucleicos.

Classificadas conforme 2 critérios:

1. Local de ação:
• Exonucleases
• Endonucleases

2. Tipo de substrato:
• Desoxirribonucleases (DNA)
• Ribonucleases (RNA)
 TRANSCRIÇÃO

Adaptado de Alberts et al. (2002) Molecular Biology of THE CELL, 4nd edition, GS Garland Science Taylor & Francis Group
 Transcrição X Replicação
Aspectos Comuns:
 Direção da síntese 5’  3’;
 Necessidade de um molde;
 Inicia a partir de uma sequência específica – sequência de
iniciação
 3 fases: Iniciação (reconhecimento do promotor), elongação e
terminação (acoplada ao processamento)

Aspectos Diferenciais:
 Não requer “primer” (iniciador);
 Apenas um segmento de DNA é Transcrito;
 Uma das fitas de DNA serve como molde;
A RNA polimerase copia uma das fitas do DNA em RNA

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.

Fita senso ou codante: sequência “idêntica” a do mRNA

Fita antisenso ou molde: sequência complementar a do mRNA
 TRANSCRIÇÃO

• Principais classes de RNA

rRNA
tRNA
mRNA
Outros pequenos RNAs - diversas funções celulares

• RNA POLIMERASE
Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares
Em eucariotos, a
transcrição
ocorre no núcleo

Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares
A transcrição usa
uma fita molde de
DNA para
sintetizar RNA

Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares
RNA imaturo ou
pré-RNA

Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares
 Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares

A
A transcrição
transcrição usa
usa
uma
uma
Diferentes
fita
fita molde
molde
tipos
de
de
DNA
DNA
de RNA
para
para
sintetizar
sintetizar RNA
RNA
Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares

Subunidades de
RNA ribossomal
envolvidos na
síntese proteica.
Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares

Cada RNA
transportador
carregará um
aminoácido
 O ribossomo
utilizará o RNA
mensageiro para
a síntese cadeia
polipeptidica

Diferentes
funções
biológicas
dos RNAs
celulares
 CODÓN

O RNA é transcrito a partir da

fita molde e sua seqüência é
idêntica a da fita codificadora
(U/T)

(A – C – G – T) = 4 LETRAS

CÓDON = 3 LETRAS

43= 64 COMBINAÇÕES

64 COMBINAÇÕES SE TEMOS 20
AMINOÁCIDOS???
 CÓDIGO GENÉTICO UNIVERSAL E DEGENERADO
Universal porque vale para todos os microrganismos e degenerado porque existem
tricas diferentes para codificar um mesmo aminoácido.
DNA Quem é a fita codificante?

5’-ATG AAG TTC TCC ACC TTT TTG GCA GTA GGG GCT GCC CTT GAA TAA-3’

3’-TAC TTC AAG AGG TGG AAA AAC CGT CAT CCC CGA CGG GAA CTT ATT-5’

Qual das 2 fitas foi

Transcrição
a molde ???

mRNA

5’-AUG AAG UUC UCC ACC UUU UUG GCA GUA GGG GCU GCC CUU GAA UAA-3’

Síntese Protéica (Tradução)

M K F S T F L A V G A A L E stop

N-terminal Proteína C-terminal

 RNA POLIMERASE

Apoenzima Holoenzima

Modelo esquemático da RNA polimerase de E. coli

Subunidade α: Reuni as subunidade e se liga ao DNA

Subunidade β e β’: Sítio ativo
Subunidade ω: Promove a reunião das subunidades, está associada com ao
enovelamento e proteção da subunidade β’.
Subunidade σ: reconhecimento e ligação da região promotora no DNA.
 3-Região Promotora

Espaçadores

TTGACA N17 TATAAT N6 Região a ser transcrita

Região -35 Região -10 Sítio de início de

(TATA box ou transcrição (+1)
Pribnow box)

Seqüências consenso de promotores de E. coli

Região promotora
 DIVERSIDADE DE PROMOTORES
Promotores
Eucarióticos da RNA
Pol II apresentam uma
grande diversidade de
outras sequências
curtas

eficiência e
regulação da
transcrição

Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001.
Fatores gerais de transcrição
Fatores gerais de transcrição
2-RNA Polimerase DNA Dependente

Bolha de transcrição
Fita
RNA
codificadora polimerase
Re-anelamento
Desanelamento

Fita molde
DNA-RNA Sítio ativo
híbrido, 8 pb

Direção da transcrição
4-Transcrição em E. coli
Sítio de iniciação
sobre a fita molde
Iniciação Sítio de terminação
sobre a fita molde

A polimerase se liga à
sequência promotora
no duplex de DNA.
“Complexo fechado”
Promotor
A polimerase separa o
duplex de DNA próximo
ao sítio de iniciação da
trancrição, formando
uma bolha de transcrição.
Bolha de Região -10
“Complexo aberto”. transcrição à +2 ou +3

A polimerase catalisa a
ligação fosfodiéster dos
dois rNTPs iniciais.
Subunid. σ é liberada

Etapa de início da transcrição

 4-Transcrição em E. coli

Elongação
A polimerase avança sobre a
fita inferior 3’ 5’,
separando o duplex de DNA
e adicionando RNA nascente Região híbrida
ribonucleotídeos ao RNA DNA-RNA
em crescimento

Etapa de elongação da transcrição

Não possui atividade revisora 3’ 5’
Taxa de erro 104 e 105
A síntese do RNA é processiva
Regiões ricas em G-C diminuem a velocidade da
RNAP
 4-Transcrição em E. coli

Terminação
No sítio de terminação da
transcrição, a polimerase
libera o RNA completo e se
dissocia do DNA
Fita completa
de RNA

Etapa de término da transcrição

•Terminação Rho-dependente: proteína Rho desestabiliza a

ligação da RNAP e o DNA

•Terminação Rho-independente: formação de um grampo de

RNA
Expressão gênica = transformação da
informação do DNA em moléculas
funcionais
Terminação intrínseca vs. dependente de Rho:
 Processamento
Pré-mRNA mRNA maduro

Adaptado de Alberts et al. (2002) Molecular Biology of THE CELL, 4nd edition, GS Garland Science Taylor & Francis Group.
ETAPAS PARA GERAÇÃO DO TRANSCRITO MADURO
GENES – OVOALBUMINA E HEMOGLOBINA
Visão geral do processamento de um pre-mRNA eucariótico
Splicing
Demonstração de sequências não-codificantes no gene
de ovoalbumina de galinha através do híbrido RNA-DNA
 Modificações pós-transcricionais do pré-mRNA

• Adição da estrutura CAP na extremidade 5’

• Adição da cauda poli(A) na extremidade 3’

• Splicing nuclear do pré-mRNA

- cis-splicing
- trans-splicing

• Edição do RNA (RNA editing)

 N = qualquer nucleotídeo
P = fosfato
Adição da estrutura 5’ Cap dos mRNAs Gp = Guanosina
M7 = grupo metil na guanosina
M = grupo metil nas riboses
(ocorre em alguns mRNA de
euccariotos
 “Capeamento” do mRNA

5´ 5´!!!

Estabilidade -> Sem o cap 5’, ribonucleases e fosfatases poderiam degradar o mRNA
Transporte -> Enzimas reconhecem o Cap 5’ e auxiliam no transporte para o citosol
Iniciação da tradução -> reconhecimento para o início da transcrição
POLIADENILAÇÃO
 Adição da cauda
Poli(A) ao pre-mRNA
Eucariótico
Sinais de poliadenilação

João B. N. Aguiar
• Cada trinca (três nucleotídeos) no RNAm é
denominado códon e corresponde a um aminoácido na
proteína que irá se formar

1 códon = 3 nucleotídeos no RNAm

7 códons é = a quantos nucleotídeos ?

Transcrição e processamento de RNA
Os aminoácidos são codificados por
grupos de três bases iniciando em
pontos determinados
Amino-
ácido

Anticódon
 RNAt

• A ligação entre códon do

RNAm e anticódon do RNAt é
antiparalela;
• O códon é lido de 5’ para 3’; o
anticódon também deve ser
lido de 5’ para 3’. Portanto a
primeira base do códon pareia
com a última base do
anticódon;

U A C

A U G

METIONINA
RNA TRANSPORTADOR - RNAt

Estrutura bidimensional
 Relembrando
•1 códon  3 nucleotídeos no RNAm

•1 códon  1 aminoácido na proteína

•Anti códon  3 nucleotídeos no RNAt

•Nº de ligações peptídicas  Nº de

aminoácidos – (menos) 1.
O RNA de transferência ou transportador (tRNA):

As moléculas de RNAt apresentam,

em uma determinada região, uma
trinca de nucleotídeos que se
destaca, denominada anticódon

É através do anticódon que o RNAt

reconhece o local do RNAm onde deve
ser colocado o aminoácido por ele
transportado.

Cada RNAt carrega um aminoácido

específico, de acordo com o anticódon
que possui

(estrutura tridimensional)
 SÍNTESE DE PROTEÍNAS

RNAm – RNA mensageiro

RNAr – RNA ribossomico
RNAt – RNA transportador
 Componentes da Tradução
Simplificado
• Aminoacil-RNAt sintetase:
– Família de enzimas que ligam AA
aos seus RNAt → ↑
especificidade que aumenta a
fidelidade da tradução da
mensagem genética;
Componentes da Tradução
Detalhado
tRNA ligado ao aminoácido
Ligação peptídica

A ligação covalente C-N forma a ligação peptídica

 Alongamento
Dividido em 3 etapas:
1) tRNA carregado liga-se ao sítio A;
2) Formação da ligação peptídica entre os
aa que estão ligados aos tRNAs nos sítios P
e A;
3) Translocação -> movimento do ribossomo
no sentido 5’ -> 3’.
Requer:
• RNAm
• aminoacil-tRNA de iniciação – • Subunidade 30S e 50S
• Fatores de iniciação
metionina • GTP
• códon de iniciação - AUG •Cofator enzimático – Mg+2
Alongamento
Alongamento:
Fatores de alongamento são necessários (EF-
Tu, EF-Ts, EF-G);

EF-Tu (fator Tu de alongamento) -> liga-se a um

GTP + tRNA
carregado (complexo triplo);

EF-Ts (fator Ts d e alongamento) -> regenera

EF-Tu –GDP em EF - Tu – GT P;

EF-G (fator G de alongamento) -> necessário

para mover o ribossomo para o próximo códon
(translocação)
Alongamento da proteína

Peptidil transferase
(ribozima)
Alongamento da proteína

O ribossomo se move em direção à

extremidade 3´do mRNA, o peptidil-
tRNA está, agora, no sítio P deixando
o sítio A aberto para o terceiro
aminoacil-tRNA. O tRNA não-
carregado é deslocado para o sítio E,
desligando-se imediatamente do
ribossomo. A translocação envolve o
complexo fator de elongação EF-G-
GTP.
Terminação

RF -> Proteínas de fator de liberação

O RF1 reconhece os códons de

terminação UAG e UAA, e o RF2
reconhece UGA e UAA.

Ou o RF1 ou o RF2 (dependendo de que

códon esteja presente) liga-se ao códon
de terminação e induz a peptidil
transferase a transferir a cadeia
polipeptídica crescente para uma
molécula de água em vez de para um
outro aa.

•RF3 forma um complexo com GTP e

liga-se ao ribossomo
 DNA
Controle
Transcrição
transcricional
pré mRNA
capping
Processamento poliadenilação
splicing
mRNA
Núcleo

Citoplasma Transporte
mRNA
Controle Degradação
Tradução localização
pós transcricional Estocagem
estabilidade

proteína mRNA inativo

Modificações
Pós traducionais
Expressão gênica em
Proteína
ativa/inativa eucariotos
 Representação esquemática da estrutura geral de um
mRNA eucariótico

CAP 5´ UTR ORF = CDS 3´ UTR

5´ AAAAAAA 3´

Região Codificadora

UTR: do inglês Untranslated Region (Região não traduzida)

ORF: do ingês Open Reading Frame (fase aberta de leitura)