Análisis de genomas

microbianos
 Secuencia Genómica
• Implica la secuenciación de una librería compuesta
por fragmentos aleatorios redundantes que abarcan
todo el genoma y se genera por cortes aleatorios
(Shotgun). Se secuencia entre 6 y 10 veces.
• Tras la secuenciación se ensambla, se rellenan huecos,
se anota y se localizan y predicen los posibles genes
• La disponibilidad de la secuencia completa ofrece un
repertorio de todos los factores de virulencia e
inmunógenos potenciales
 Análisis de la diversidad
• Variable contenido cromosómico:
” las bacterias contienen un único cromosoma circular y ocasionalmente plásmidos circulares”
• Vibrio Cholerae: 2 chrom. circulares (2,69 y 1,07 Mb)
• Borrelia burgdorferi: 1 cromosoma lineal (0,91 Mb) y 17 plásmidos lineales y circulares
• Variable contenido G +C:
• Borrelia burgdorferi: 29 % G+C
• Mycobacterum tuberculosis: 65% G+C
• Descripción genética muy limitada:
• Escherichia coli: ≈ 40% de sus genes sin función conocida
• Mecanismos de diversidad y virulencia:
• Transferencia lateral de genes causantes de virulencia.
• Decaimiento genómico y adaptación al hospedador
• Variación de fase y antigénica.
 Transferencia lateral de genes
• Mecanismo de diversificación de la virulencia: muy
documentada entre patógenos entéricos.
• Mecanismos:
– Transformación
– Conjugación (transposones, plásmidos)
– Transducción (bacteriófagos)
– Recombinación genómica.
• La transferencia implica grupos de genes (de 5 a 100 kb)y
puede convertir un organismo benigno en otro patógeno.
• Si contribuyen a la virulencia se denominan PI
(pathogenicity islands).
• Ejemplos de PI: sistemas de secreción tipo III y tipo IV
 Transmisión lateral de genes de virulencia:
Sistemas de secreción bacterianos tipo III y tipo IV
• Codifican estructuras especializadas que
actúan como jeringuillas moleculares para
introducir moléculas efectoras (generalmente
toxinas) en la célula hospedadora
• Presentes en bacterias patógenas Gram
negativas
• Los genes que codifican estas estructuras
están muy conservados entre bacterias y se
piensa que se han transmitido por
transferencia lateral
• Las moléculas efectoras que inyectan son
específicas de cada tipo de bacteria.
• Tipo III en: E.coli, Slamonella enterica,
Bordetella bronchiseptica, Pseudomonas
areuginosa, Chlamydia, Shigella y Yersinia
spp.
• Tipo IV en : H. pylori, E. coli, B. pertusi
Legionella pneumophila.
 Transmisión lateral de genes de virulencia:
Detección de las Islas de patogenicidad por análisis
genómico.
• Base teórica:
– Los loci adquiridos por transmisión lateral poseen un contenido de G+C relativo distinto del resto
del genoma.
– Este hecho permite el análisis informático de la secuencia total de un genoma para localizar picos
de variación en el contenido de G+C
– Se puede así medir y comparar el efecto de la transmisión lateral de genes entre patógenos.
• Primeros estudios:
– Confirman que las bacterias han sufrido frecuentemente transferencia de genes.
– Muchos de estos genes pueden ser determinantes de la virulencia.
– Helicobacter pylori (26695) presenta 30 picos de variación G+C y Campylobacter jejuni muy
poca evidencia de transferencia lateral de genes. Sus genes housekeeping son muy similares
mientras que los genes responsables de su patogenicidad son muy divergentes. Helicobacter pylori
(26695) y Helicobacter pylori (j99) poseen un 7% de genes diferentes agrupados en una región
hipervariable del genoma denominada zona de plasticidad.
– Neisseria meningitidis serotipo B es una bacteria naturalmente competente con un genoma de
2.23Mb y una gran evidencia en su genoma de múltiples sucesos de transferencia lateral de genes:
1.910 señales de captación de DNA. Tres grandes regiones de variación en G+C (dos con genes de
patogenicidad.
– Vibrio Cholerae. Se ha sugerido que su segundo cromosoma es un megaplásmido
 Decaimiento genómico:
• Generalizaciones:
– La perdida de genes se incrementa con la adaptación al hospedador.
– Incremento del uso de los procesos celulares del hospedador
– Fenómeno muy evidente en parásitos intracelulares.
• Primeros estudios:
– Ricktessia prowazeki (genoma de 1.11 mb). Pose muchos pseudogenes y la
mayor proporción de DNA no codificante entre procariotas (> 24%). sPerdida de
genes no necesarios para su vida intracelular. Genoma sorprendentemente
similar al mitocondrial. F
– Mycobacterium leprae presenta numerosos pseudogenes. Metabolismo muy
restringido y rango de hospedadores muy estrecho.
– Mycobacterium genitales Mínimo numero de genes entre los seres vivos con el
mínimo número de genes (Micobaterias). Genoma de 0.58Mb
– Yersina pestis se encuentra en una situación intermedia. Por un lado aumento del
genoma por transferencia vertical. Adquisición de tres plásmidos (uno genera
virulencia: sistemas de secreción de tipo III). Por otra parte sufre reducción del
genoma por decaimiento. Al menos presenta 100 genes interrumpidos.
 Variación de fase/Variación antigénica:

• Definiciones:
– Variación de fase: la perdida o ganancia reversible de características
fenotípicas como resultado de cambios de expresión de uno o varios
genes.
– Variación antigénica: la variación de las estructuras superficiales del
microorganismo patógeno.
– Ambas son estrategias de supervivencia comunes en bacterias patógenas.
• Mecanismos:
– Deslizamiento de una cadena por mal apareamiento de bases en zonas se
secuencia repetida durante la replicación.
– Genes de contingencia: genes con variaciones en secuencias repetidas
simples de uno hasta cinco nucleótidos.
– Casi exclusivos de patógenos de mucosas con genomas relativamente
pequeños
– Generalmente asociados con síntesis de estructuras de la superficie
celular o con genes del sistema de restricción/modificación del DNA
– Tracts homopoliméricos: unidades repetitivas de un nucleótido.
– Mecanismo alternativo de variación antigénica es la duplicación de
genes.
• Consecuencia:
– La alteración de la longitud de estas zonas inmediatamente antes de
secuencias codificantes puede situar a los genes fuera de fase y afectar a
su expresión
– Se producen cambios fenotípicos en bacterias individuales dentro de una
población en crecimiento clonal.
– Escape de los mecanismos de defensa inmunitaria del hospedador
 Variación de
fase/Variación antigénica:
• H. influenzae:
– Una docena de genes de contingencia con tracts
homopoliméricos.
– Cuatro de ellos implicados en la síntesis de lipopolisacáridos
– Cuatro implicados en la captación de hierro.
• H. Pylori:
– Presenta veintisiete genes de contingencia potenciales.
– Dos de ellos son genes para la a-3-fucosiltranferasa, enzima
responsable de la expresión variable de los antígenos de
superficie Lewis X y Lewis Y.
• N. Meningitidis:
– Serotipo B línea MC58: 65 genes de contingencia potenciales.
La mayoría de ellos implicados en procesos de interacción con el
hospedador (proteínas de membrana, pili, lipopolisacáridos,
cápsulas)
– Serotipo A línea Z2491: Contiene cientos de elementos
repetidos, desde cortos tracts homopoliméricos hasta
duplicaciones completas de genes. Extrema fluidez genómica
• C. Jejuni:
– 25 genes de contingencia agrupados en tres zonas del genoma
donde se localizan los genes responsables de la síntesis de
lipopolisacáridos (LOS), de la síntesis de la cápsula y de la
síntesis del flagelo.
– Ejemplo: síntesis de la ß-1,3 galactosiltransfereasa responsable
de la síntesis del gangliósido GM1
 Objetivos de agentes microbianos y vacunas
• Perspectivas:
- Los análisis de genomas completos producirán un inventario completo de los genes que
codifican cada uno de los factores de virulencia y cada uno de los agentes inmunogénicos
susceptibles de ser atacados.
• Vacunas de DNA:
- El DNA es un atractivo agente inmunogénico: Es estable y fácil de producir.
- ELS o GI (expression library screening or genomic immunization): Inmunizar animales con
mezclas de fragmento de DNA y re-examinar los que den respuesta inmunitaria fuerte para
identificar el DNA causante.
- La disponibilidad de genomas completos permite el diseño racional de vacunas por este
método. Ejemplo: Mycoplasma pulmonis.
• Identificación de antígenos de superficie:
- N. Meningitidis tipo B MC58
• 2158 secuencias de proteínas.
•570 antígenos de superficie potenciales, excluidos los genes de contingencia.
•Expresión de los 570 en E. Coli. Solo 350 pudieron expresarse
•Inmunización de ratones con los 350 expresados
•85 proteínas dieron una respuesta inmunogénica fuerte y se evaluó la respuesta bactericida de los anticuerpos in vitro.
•Evaluación de su conservación entre serotipos mas comunes de N. meningitidis: 7 candidatos.
•Los siete candidatos son antígenos de superficie cuya eficacia como vacuna está en evaluación.
• Generación de patógenos, atenuados por ingeniería genética, como vacunas:
Inmunización Genética
Inmunización Genómica

Librería de expresión (EL)

Selección de los
antígenos más
inmunogénicos
Genómica funcional: Localización de
genes importantes en el proceso patológico
• La adquisición y el análisis de las secuencias genómicas no
es el objetivo final, sino un punto de partida.
• Las Homologías dan ‘ pistas ’, pero no demuestran la
función de los genes.
• Un número elevado de genes existentes en los patógenos
codifican proteínas de función desconocida.
• Es preciso volver al “laboratorio húmedo”
• Técnicas de alto rendimiento-Genómica funcional:
– Análisis por mutagénesis.
– Hibridación de ácidos nucleicos
– Química de proteínas.
– Bioinformatica
 Genómica funcional
• 1) Análisis de la activación de genes (Mutagénesis)
– IVET: In vivo expression technology
– DFI: Differential fluorescence induction
– STM: Signature -tagged mutagenesis
– GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition
• 2) Análisis de Transcriptomas
– DNA chips o micro-arrays
– SAGE: Serial analysis of gene expression
– DD:Differential display
• 3) Análisis de Proteomas
– 2D PAGE
– Espectrometría de masas
– Protein micro-arrays
 Genómica funcional:
Localización de genes importantes en el
proceso patológico
• Principio básico
“ El grupo de genes que expresa un organismo
patógeno en su reservorio ambiental difiere
sustancialmente del grupo de genes que expresa
durante su etapa patógena.”
– Resulta probable que algunos genes inducidos in vivo (en
el hospedador) jueguen un papel crítico en el proceso
patogénico.
– ¿Es posible diseñar técnicas de captura de dichos genes?
 IVET
In Vivo Expression Technology
 Tecnologías de expresión in vivo
•
IVET
Método de selección positiva:
– Sistema de selección de promotores de genes activados
durante el proceso infectivo y que están poco o nada activos
en el periodo no infectivo
– Proceso:
1. Dos genes marcadores situados en tandem se fusionan
aleatoriamente con fragmentos del genoma del
microorganismo a estudiar generando una librería de
fragmentos genómicos
2. Se transforman las cepas a estudiar con la librería de
fragmentos genómicos.
3. Se infecta al animal y se extraen las células supervivientes.

Principio:
–El primer gen del tandem permita la supervivencia in vivo si es
expresado.
–El segundo gen del tandem (lacZY) permite distinguir las cepas
que se expresan in vitro: Color azul.
–Interesan los clones supervivientes que no se expresan in vitro:
Colonias blancas extraídas del animal infectado.
–Genes testigo:
•∆purA, selección auxotrófica
•Genes de resistencia a antibióticos
 Tecnologías de expresión in vivo
IVET
• Método de selección negativa:
– Permite la detección de actividad de
promotores durante un período muy
corto de la infección
– Principio:
• Si el promotor esta activo la
resolvasa eliminará el gen de
resistencia a tetraciclina y por tanto
el microorganismo pasara de
resistente a sensible.
• Se añade tetraciclina in vitro y se
buscan células sensibles a
tetraciclina y blancas.
Tecnologías de expresión in vivo
IVET
• IVET con selección auxotrófica:
– Genes testigo: purA y lacZ
– Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ∆pur A)
• La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando
infecta ratones
– Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad.
• IVET con selección antibiótica:
– Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ
– Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior
se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida.
– Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos,
unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente
nuevos.
• IVET con resolvasa:
– Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a
tetraciclina.
– Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el
metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o
completamente nuevos.
– Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto
similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.
 Differential Fluorescence Induction
• Método de selección positiva:
– Como gen testigo se utiliza la GFP (Green
Flourescent Protein)
– Se utiliza un sistema automático de selección
de células individuales según su fluorescencia
FACS.
– Principio:
• Si el promotor está activo se sintetiza la
GFP y la bacteria fluoresce.
• Se cultivan in vitro las bacterias
fluorescentes in vivo y se seleccionan
aquellas que pierden su fluorescencia en
el nuevo medio.
– Salmonella thyphimurium.:
• Identificados 14 genes inducidos en
macrófagos.
• 8 poseen homólogos en otras bacterias
con función conocida
• 6 sin homología con otros genes u
homólogos a genes de función
desconocida
Differential Fluorescence Induction

Salmonella typhimurium
 Genómica funcional
• 1) Análisis de la activación de genes (Mutagénesis)
– IVET: In vivo expression technology
– DFI: Differential fluorescence induction
– STM: Signature -tagged mutagenesis
– GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro
transposition
Tecnologías de expresión in vivo
IVET
• IVET con selección auxotrófica:
– Genes testigo: purA y lacZ
– Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ∆pur A)
• La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando
infecta ratones
– Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad.
• IVET con selección antibiótica:
– Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ
– Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior
se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida.
– Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos,
unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente
nuevos.
• IVET con resolvasa:
– Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a
tetraciclina.
– Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el
metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o
completamente nuevos.
– Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto
similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.
Signature-tagged mutagenesis
Signature-tagged mutagenesis

DNA tag (o código de Barras

 Signature-
tagged
mutagenesis
Signature-tagged
mutagenesis
 Factores limitantes de la STM
• STM evalúa la capacidad del patógeno para
dividirse en una población heterogénea.
• Se espera que identifique genes de virulencia no
compensables por otros patógenos virulentos del
mismo inóculo.
• Factores determinantes:
– La complejidad del inóculo.
– La dosis
– La ruta de administración
– La duración de la infección
 Desventajas de IVET y STM

• IVET:
– Dependen demasiado de la no expresión de genes “in vitro”.
– Desestima los genes que deban atenuarse durante la infección.
– Los genes ivi deben ser mutados posteriormente para demostrar su
requerimiento en la infección.
– No detecta genes esenciales
• STM:
– No selecciona positivamente.
– Desestima los genes que deban atenuarse durante la infección.
– La mutagénesis puede no ser verdaderamente aleatoria.
– No detecta genes esenciales.
 GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)

• Principio:
– Sistema de identificación de genes esenciales para la
supervivencia del microorganismo
– Útil en organismos cuyo genoma esta
completamente secuenciado.
– Utiliza la técnica de footprinting por PCR
– Precisa de unos 130 cebadores por Mb de DNA
investigado
– Sistema de selección negativo
•Aplicación práctica
– Haemophilus influenzae. En crecimiento in vivo y
en infecciones en animales (ratón)
– Streptococcus pneumoniae. En crecimiento in vitro
GAMBIT (Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)
 GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)