Cultivos Microbianos

Dr. Claudio Voget

Curso CABBIO, Noviembre 2005
Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento

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Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos, la asimilación del C deriva de 8
intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA,
oxalacetato, -cetoglutarato.
 Conceptos básicos de cinética microbiana

qi velocidad específica ri velocidad volumétrica

de consumo de sustrato de consumo de sustrato
o formación de producto o formación de producto
(qi mmol/ g biomasa x h ) ri ( mmol/ litro x h )
P ri = qi * X
qp
qO2 X concentración de biomasa
O2
µ
S
qS
qCO2

CO2
V
estado fisiológico de la célula
rO2 = qO2 * X
(flujos metabólicos)
Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades !
 Rendimientos verdaderos y mantenimiento

rx
d1 CH2O + α1 NH3 + β1 O2  g1 biomasa + δ1CO2 + w1H2O + Δh1
rs rsx
S
rp
rN
d2 CH2O + α2 NH3 + β2 O2 
r s2 producto + δ2 CO2 + w2H2O + Δh2
NH3 sp

rO2
O2
d3 CH2O + β3 O2 r
sm mantenimiento + δ3 CO2 + w3 H2O + Δh3
g 1 rx s 2 rp
y' x / s   y' p / s  
Rendimientos verdaderos d 1 rsx d 2 rps

(d1+d2+d3) = d , (α1+ α2) =α , (β1+ β2+ β3) = β , (δ1+ δ2+ δ3) = δ, Si d=1  α=a, β=b, δ= yco2/s

rx , rp
CH2O + a NH3 + b O2 yx/s biomasa + yp/s producto + yco2/s CO2 + w H20 + Δh
rs ,rO2
g 1 rx s 2 rp
Rendimientos experimentales yx / s   yp / s  
d rs d rs
yx / s  y ' x / s yp / s  y ' p / s
 Ecuación lineal de consumo de sustrato (ELCS)

rx rp
rs  rsx  rsp  rsm rs    m s x
y 'x / s y 'p / s

rx 
rp = 0 rs   ms x qs   ms
y'x / s y' x / s

ms = 0.05 g glucosa / g biomasa x h

1 1 ms µ (h-1) yx/s / y´x/s

 
yx / s y'x / s  0.05 0,645

0.1 0,78

0.3 0,92
 Factores que afectan la velocidad de crecimiento (µ)

Temperatura Ecuación de Monod µ = f(S)

pH u
øH2O  0.S5
S
q q s
E
i
µ
u max
ext int
Composición del medio
membrana
celular
Se Se
vs  v max ≡ qs  qs max
u
1,0
Se  Km Se  Ks
u max
  qs * yx / s
0,8

S (g /l)
0,6
u
 0 .5
u max 0,4

Se
   max
0,2

S  Ks
0,0

Se  Ks
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12

S (g/l)

cultivo cultivo
restricto irrestricto µ ≠ f(S) Ks = ug a mg/l
Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana

Crecimiento de Saccharomyces cereviseae

El metabolismo de S cereviseae es
netamente oxidativo hasta una µ de
0.2-0.25 h-1. Por encima de este valor
se induce la fermentación alcohólica
dando lugar a un metabolismo mixto
oxidativo-fermentativo. El rendimiento
celular disminuye. La producción
aeróbica de etanol en S. cereviseae se
denomina Efecto Crabtree

µ < µcrit CH 2O  b O 2  a NH 3  yx / s X  yCO 2/ S CO2  

µ > µcrit CH 2O  b O 2  a NH 3  yx / s X  yco 2 / s CO2  yp / s EtOH  
Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana

Parámetros de crecimiento y actividad β-galactosidasa

Cultivo Continuo (µ = 0.1 h-1)

Nutriente Yx/s Actividad Carbohidratos Proteína

limitante g/g LAU/mg totales % %

Glucosa 0.44 0.19 30 42.5

Lactosa 0.47 18 30 43.5

Amonio 0.38 3.2 52 29

Batch (fase estacionaria)

Lactosa 0.40 4.3 - -

Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 ºC, pH 4.7, Medio definido

 Sistemas de cultivo

Los procesos fermentativos pueden

dividirse básicamente en 2 grandes
grupos

Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS)

Contenido de agua del medio 90-95 %

Fermentaciones en sustrato sólido (FSS)

El medio son partículas húmedas con ausencia o
casi ausencia de agua libre
Reactores empleados en fermentaciones líquidas
sumergidas
 Fermentación en sustrato sólido

Hay dos formas básicas de cultivos sólidos

Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos
agroindustriales)
Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo
(inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano)

Comparación a
nivel de
microescala
entre FLS y FSS
Tipos de reactores empleados en fermentaciones en
sustrato sólido
 Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida
FSS
Medios simples. Requieren adición de agua o una
solución mineral. Sustratos variables
Bajo øH20 reduce riesgos de contaminación
Medios concentrados. Elevada concentración de
producto Menor volumen de reactor
Menor consumo de energia para aerear
Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusión
puede limitar el proceso
Remoción de calor es crítica. Transferencia de
calor por evaporación puede ser importante
Control del proceso dificultosa.
Estimación de biomasa no es directa
Downstream processing simple. Contaminación
de producto con componentes del medio es alta
Bajos volúmenes de efluentes líquidos
Cinética y fenómenos de transporte poco
conocidos
Fermentación sumergida
Medios con mayor cantidad de ingredientes,
mayor costo. Buena reproducibilidad en medios
definidos
Mayores riesgos de contaminación
Medios diluídos, Volúmenes de fermentación
grandes. Altas concentraciones de medio puede
afectar crecimiento. Alimentación de sustrato es
común
Transferencia G-L es generalmente limitante
Mezclado intenso.
La difusión de nutrientes es generalmente no
limitante
Alto contenido de agua facilita control de T ra
Amplio desarrollo en sistemas de medición y
control
La remoción de grandes volúmenes de agua
aumenta costos en los procesos de separación y
purificación
Modelos cinéticos y difusionales
 Operación de reactores

Co, Fo, Y, Fgs

VL VG
C Y

C, FS
Yo, Fgo
Ecuaciones de interfase G-L

balance
d CVL
Fase líquida  Fo Co  Fs C  ri VL  rdi VL  transfiere
dt
dYVG
Fase gaseosa  Fgo Yo  Fgs Y  transfiere
dt
 Cultivo Batch
Es el cultivo mas simple
Volumen constante
Cerrado para fase líquida Fo = Fs = 0
Composición inicial del medio determina el curso del cultivo

Xf  Xo
5 10
35
r max
Y x/ s  
S0 o2
30
4 8
X
f
Sf  S 0
X (biomasa) g/l

25
(mmol / L x h)

glucosa (g/l)
3 6
20

15 2 4

Xf  X o
rO2

10
1 2
Yx / o  t
0 ro 2 dt
5

X0 Sf
0 0
0 2 4 6 8 10 12 14

tiempo (h)
inóculo Fase exponencial
 Cultivo Batch
Fo  Fs  0 VL  cte
d Ci d Ci
 ri  transfiere ó  ri
dt dt
1,5
Balance para biomasa
1,0 estacionaria
dX
0,5 desaceleración  rx   X   f (t )
dt
ln X

0,0
dX
-0,5
m (pendiente) = µmax   max X
dt
-1,0
 max t
-1,5
exponencial
X  Xo e
0 2 4 6 8 10 12
Lag tiempo (h) ln Xt  ln Xi   max t
Velocidades de crecimiento de microorganismos y células

tiempo de
Cultivo µ (h-1) duplicación
(h)

bacterias 0,6-1,4 0,5-1,15

levaduras y
hongos 0,2-0,6 1,15-3,0
filamentosos

células animales 0,01-0,04 17-70

células vegetales 0,007-0,03 23-100

 Fase de desaceleración y estacionaria
Puede deberse a inhibición por producto, agotamiento de
nutrientes, limitación por oxígeno
En medios complejos la fase de desaceleración es mas
extendida en comparación con medios definidos.
La característica de la biomasa al final del batch puede ser
controlada con la composición inicial del medio (el cultivo
puede limitarse en C, N, P, etc)
En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a
la falta de nutrientes (condición de starvation): supervivencia
prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de
stress (salino, térmico, oxidativo, osmótico), etc. Hay expresión
diferencial de genes al entrar al estado estacionario
Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se
mantienen viables (viables no cultivables)
 Desventajas del cultivo batch

Dificultad de controlar el µ, excepto variando la

composición del medio o las condiciones de proceso
Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el
crecimiento debido al aumento de la presión osmótica
del medio o toxicidad de nutrientes
Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación
debido a una insuficiente capacidad del reactor para
transferir O2 al medio

Inconvenientes para remover calor

Tiempos muertos entre procesos disminuye la
productividad. Pie de cuba
 Cultivo continuo
El tipo básico es el quimiostato, que consiste en una
suspensión celular perfectamente mezclada a la cual se
adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira
cultivo a igual velocidad, de este modo el VL es cte. La
composición del medio que se alimenta se diseña según que
sustrato es el limitante

Cio
rebalse

Fo, Ci
Ci
medio
fresco Fo

reservorio bomba
BIOREACTOR
 Cultivo continuo

10

4
X
8

Sustrato limitante (g/l)

3
6
X (g/l)

2
4

transitorio estacionario
1 2

s
0 0
0 10 20 30 40 50

tiempo (h)

inicio alimentación
 Cultivo continuo

Fo  Fs  F VL  cte
d Ci
VL  F (Cio  Ci )  ri VL  transfiere
dt
dCi
en e.e 0
dt

D (Cio  C i )  ri  transfiere  0
F
D D velocidad de dilución ( h 1
)
VL
 Cultivo continuo
Balance de biomasa

 D X  rx
rx  D X como rx   X entonces   D
Balance de sustrato

rs  D ( So  S ) rx X
yx / s  
D ( So  S ) rs D (S 0 S )
qs 
X
Balance de producto
D P
rp  D P qp 
X
 Cultivo continuo

S S D Ks
   max D   max S 
Ks  S Ks  S  max  D

Balance de sustrato con mantenimiento (rp = 0)

rx
D ( So  S )  (  ms X )  0
y 'x / s

Y ' x / s D ( So  S )
X 
D  ms Y 'x / s
 Cultivo continuo

Y 'x / s D ( So  S ) S 
D Ks
X 
D  ms Y 'x / s  max  D

µmax = 1.0 h-1

1 ,2 2 ,5

X (m s = 0 )
1 ,0
2 ,0
X (b io m a s a ) g /l

g lu c o s a (g /l)
0 ,8
1 ,5
Y´x/s = 0,5 gX /gS
0 ,6

0 ,4
1 ,0
ms = 0,05 gS/gX h
X 0 ,5
0 ,2
Ks = 5 mg/l
0 ,0 0 ,0
0 ,0 0 ,2 0 ,4
D (h
-1
)
0 ,6 0 ,8 1 ,0
S0 = 2,0 g/l
 Aplicaciones del cultivo continuo

Estudios fisiológicos. Se puede discriminar el efecto de

la velocidad de crecimiento y de las condiciones de
cultivo en la fisiología celular.
Varío la composición del medio y parámetros del
cultivo a µ =cte
Varío µ manteniendo cte el resto de los parámetros
Muestreo estadístico en el estado estacionario

Inconvenientes del sistema continuo

Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de
plásmidos
Contaminación
Imposibilidad de establecer estado estacionario
 Cultivo batch alimentado (B.A)
Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen varía
con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A
Controlado por alimentación: el cultivo sigue el curso que le
dicta la alimentación
Con alimentación controlada: el estado del cultivo ( captado
por sensores ) controla la alimentación

Vf

C(t) Vo
F(t)
C(t) V(t)
reservorio bomba
BIOREACTOR
Vr = Vf - Vo
 Cultivo B. A

d (CV )
 F (t ) C (t )  ri V
dt
Balance de biomasa Balance de producto

d ( XV ) d ( PV )
 rx V  rp V
dt dt
Balance de sustrato

d ( SV )
 F (t ) Sr (t )  rs V
dt
 Cultivo B. A F  cte Sr  cte

d ( XV ) d ( SV )
 rx V   ( XV )  F Sr  rs V
dt dt

d ( SV )  ( XV )
Si ms  0  F Sr 
dt Yx / s

d ( SV ) d ( XV )
0  F Sr Yx / s
dt dt

XV  Xo Vo  F Sr Yx / s t
 Cultivo B. A F  cte Sr  cte

d ( SV )  ( XV )
Si ms  0  F Sr   ms ( XV )
dt Y 'x / s

d ( XV )
 ms ( XV ) Y 'x / s  F Sr Y 'x / s
dt

F Sr F Sr  ms Y ' x / s t
( XV )   ( XoVo  )e
ms ms

F Sr
t  XV  ( XV ) max 
ms
 Cultivo B. A
El objetivo del BA es básicamente controlar el µ

Limitar la demanda de O2 del cultivo


ro 2  qo 2 X  X
Yx / o
Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto
osmótico y tóxico de nutrientes

Incrementar el qp (metabolitos secundarios, proteínas

recombinantes) para maximizar el Yp/s.

Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en

levaduras)