Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Tiempo Real
ADN molde
Primers
Taq polimerasa
dNTPs
MgCl2
Buffer
Fluorocromo
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR en Tiempo Real PCR convencional
Amplificación y detección de Amplificación y detección de
productos en una misma etapa. productos en 2 etapas separadas.
Rango dinámico de detección Rango dinámico de detección
amplio. estrecho.
Detección durante la fase Detección durante la fase
exponencial temprana (máxima exponencial.
eficiencia de reacción).
Mayor sensibilidad. Menor sensibilidad.
Mayor especificidad con el uso de Menor especificidad.
sondas.
Requerimiento de equipamiento y Requerimiento de equipamiento y
reactivos muy costosos. reactivos de bajo costo.
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR convencional.
PCR en Tiempo Real: ventajas.
Sensibilidad
Cuantificación
Monitoreo de todo el procedimiento
Disminución del riesgo de contaminación
Automatización
Amplicones pequeños
Amplio rango dinámico
Transcripción reversa
PCR en Tiempo Real: Fases de la curva de
amplificación
La retrotranscripción y amplificación
ocurren separadamente. Ventajas:
PCR en Tiempo Real en permite corroborar la eficiencia de la
dos pasos retrotranscripción y mayor sensibilidad.
Desventajas: Mayor probabilidad de
contaminación de la muestra.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Termociclador. Conforman el
Lector de mismo
Composición del equipo:
fluorescencia. instrumento.
Recolector de datos.
Energía de
excitación.
Canales de
lectura.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Muestra
ΔRn
Rn
Threshold
Control Negativo
Basal Ct
Número de ciclos
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
El umbral de fluorescencia es un parámetro modificable. Este
valor debe elegirse teniendo en cuenta que la reacción sea
cuantificada en la fase exponencial temprana.
A mayor producto de
amplificación mayor
fluorescencia!!!!
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
PCR en Tiempo Real: Expresión del nivel de
fluorescencia.
Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter
normalizada por la emisión del colorante utilizado como
referencia pasiva (ROX) medido en el NTC.
ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.
Threshold: umbral en el que se produce un cambio
significativo en la fluorescencia.
Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay
cambios mínimos en la emisión de fluorescencia.
Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida
supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el
log. del núm. inicial de copias.
PCR en Tiempo Real: Expresión del nivel de
fluorescencia.
Sistemas de detección utilizados en la PCR en Tiempo
Real.
Sistemas de detección utilizados en la PCR en Tiempo
Real.
Colorantes de unión al ADN
(SYBR Green).
Sondas que fluorescen
Las tecnologías fluorescentes
luego de su hidrólisis
utilizadas incluyen:
(sondas taqman).
Sondas de hibridación.
Sondas fluorescentes
pegadas.
Ventajas Desventajas
El mismo colorante puede La presencia de dímeros de
usarse para diferentes blancos primers y amplificaciones
de amplificación. inespecíficas generan falsos
positivos.
• Contenido de
GC.
• Tamaño del
amplicón.
PCR en Tiempo Real: realización de curvas de
disociación.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hidrólisis.
Dador
Aceptor
El método utiliza dos
primers (F y R) y dos
sondas marcadas con
fluorocromos, las
cuales hibridan
adyacentemente.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hibridación.
La sonda que hibrida corriente arriba tiene un fluoróforo dador
en 3’, y la sonda que hibrida corriente abajo tiene un fluoróforo
aceptor en 5’. El espectro de absorción del último se solapa con
el espectro de emisión del primero. Esto resulta en emisión de
fluorescencia por el fluoróforo aceptor, cuando ambas sondas
están juntas.
La transferencia de energía también se da mediante fenómeno
FRET.
La sonda que hibrida corriente abajo debe tener bloqueado su
extremo 3’, para no poder ser amplificada por la polimerasa.
En la reacción que usa 3 oligonucleótidos el fundamento es el
mismo, pero la sonda que se une corriente arriba es
reemplazada por un primer marcado con el fluorocrómo dador.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hibridación.
Ventajas Desventajas
Incrementa la especificidad Debe diseñarse una sonda
de la reacción. diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realización de PCR Relativamente más costoso.
multiplex.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas
fluorescentes plegadas (hairpin probes)
Balizas moleculares
Región secuencia
específica
Repeticiones
invertidas
Ventajas Desventajas
Incrementa la especificidad Debe diseñarse una sonda
de la reacción, aun más que diferente para cada blanco a
las demás sondas. estudiar.
Permite la realización de PCR Relativamente más costoso.
multiplex.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
PCR en Tiempo Real: Tipos de cuantificación
Se grafica Ct vs log de la
Realizar diluciones
concentración inicial de
seriada de una muestra
templado (o vs concentración
o patrones.
de DNA en la muestra)
Eficiencia cercana
al 100%.
PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa.
Método de la comparación de Ct .
β-Actina
rARN 18S
GAPDH
β2-microglobulina
Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante
el método del 2 -(ΔΔCt)
Alelos: Ala12
Pro12
Sonda 1 Sonda 2
(FAM) (VIC)
Alelo 1 Alelo 2
Match
Match
Mismatch
Mismatch
• Homocigota alelo 1:
• Heterocigota:
• Homocigota alelo 2: