Biotecnología

PCR

Prof. Tamara Zilocchi

 Objetivo de la técnica
 Hacer copias o amplificar una
secuencia especifica de ADN Genómico

en un corto periodo de tiempo.

Complementario

In vitro Se apega a las mismas reglas

de la replicación.
 ADN diana.

ADN polimerasa.

Requisitos Desoxinucleotidos.

químicos Oligonucleótidos / Primers.

Buffer.

Cofactores de la ADN polimerasa.

ADN diana

 Es el material genético que se quiere amplificar y que se

puede obtener de cualquier muestra biológica.
 Cantidad:
-gADN  300ng.
-cADN  25 / 100 ng.

 ¿Y si queremos amplificar ARN?  entonces el primer paso

será la retrotranscripción.
 La retrotranscripción es una reacción para la
conversión del ARN en ADNc.
 La realización consecutiva de una retrotranscripción y
una PCR se conoce como RT-PCR y es una variante de
la técnica convencional de PCR.
 Se utiliza la transcriptasa inversa.
 Una cadena de ARN se transcribe a ADN de secuencia
complementaria al ARNADNc.
 La transcriptasa inversa más empleada es la del M-MLV
(Murine-Moloney leukemia virus).
 Además del ARN molde, que se convertirá en ADNc, se
requieren primers, generalmente hexámeros formados de
secuencias aleatorias de 6 nt.
 Estos hexámeros hibridarán con las secuencias
complementarias a ellos, que se localizan por azar en
todos los ARN presentes en la muestra. Para la reacción se
requiere también un inhibidor de ARNsas, un componente
enzimático que impide la acción de estas enzimas que
puedan estar presentes en la muestra.
 Los dNTP (A, G, C, T) se emplearán en la síntesis de las
cadenas de ADNc, mientras que una solución
amortiguadora proporcionará las condiciones de pH y
cofactores necesarios para un funcionamiento óptimo de la
retrotranscriptasa.
 A diferencia de lo que sucede en la PCR, en esta reacción
no se requieren ciclos, y basta con una hora a la
temperatura óptima de la enzima para realizar la
conversión del ARN a ADNc (para la M-MLV son 37°C).
 Los pasos de que consta esta reacción son
desnaturalización del ARN a 70°C por 10 minutos para
eliminar estructuras secundarias, alineación de los
hexámeros por 10 min a 25°C y polimerización por la
retrotranscriptasa a 37°C por una hora.
 Una vez obtenida la cadena de ADNc, ésta se emplea como
molde para la técnica de PCR
ADN polimerasa
 Enzima que polimeriza una nueva cadena de ADN tomando como molde otra
ya existente.
 Concentración para la reacción  2.5U
 Debe ser especial para soportar cambios de temperatura que desnaturalizan
proteínas.
-Thermus aquaticus (polimerasa Taq)
– Pyrococcus furiosus (Pfu)
– Thermococcus litoralis (Vent)
– Thermus termophilus (Tli o Tth)
– Thermotoga maritima (Tma)
 Parámetros que las definen:
-Fidelidad  no deben introducir errores en la secuencia de la hebra sintetizada.
-Procesividad  promedio del número de nucleótidos insertados por evento de
binding.
-Deben ser termoactivas y termoestables.
Taq Polimerasa

 T óptima: 75-80°C.
 Moderadamente procesiva: 75 nucleótidos por seg a 70°C.
 Vida media: 2h (70-94°C), 45-96 min (95°C), 9 min (97,5°C)
 Fidelidad: 3.10-4 a 3.10-6 errores por nucleótido polimerizado
 Actividad 5’, 3’ Exonucleasa
 Cloruro de Magnesio Concentración:
(MgCl2) . -1,0 y 2,5 mM

Cofactor
Deber optimizarse de
manera experimental:
-Mucho  amplificación
inespecífica.
-Poco  disminuye la
producción.
  Solución amortiguadora.

 Proporciona el pH y
concentraciones de sales
adecuadas para la correcta

Buffer función de la enzima.

 pH 8.4

 Composición:
-Tris-HcL  trisaminometato
hidrocloruro.
-kcL  cloruro de potasio.
Desoxinucleotidos
 Monómeros de ADN.
 Necesarios para poder sintetizar la nueva hebra de ADN.
 dATP; dCTP; dGTP;dTTP  forma trifosfatada (le da
mayor estabilidad)
 Concentración:
-Entre 50 y 200 μM

Concentraciones menores a los 50 μM

generan síntesis insuficiente y
concentraciones mayores a los 200 μM
generan incorporaciones erróneas.
Iniciadores, Cebadores o Primers

Son oligonucleótidos  secuencia de ADN con 50 pares de bases o

menos.

Será necesario utilizar una secuencia específica al gen de interés.

Son utilizados para reconocer secuencias blanco en el ADN molde por

complementariedad de bases.

En la PCR convencional se utilizan un par de inciadores para delimitar

los extremos del producto que se desea amplificar  Proporcionan un
extremo 3’ libre para que la ADNp añada nucleótidos.

Determinan la longitude del producto  100 y 1000pb es possible pero

lo recomendado es entre 200 y 500 pb.
 Nombres:
-Sentido  complementario y antiparalelo a la cadena 3’5’ del ADN
molde (sentido de 5’ hacia 3’)
-Antisentido  Complementario y antiparalelo a la cadena 5’3’
(sentido de 3’ hacia 5’)

 Concentración:
0,3 a 1 μM/reacción.
-El exceso favorece la formación de dímeros entre un primer consigo
mismo y de secuestros del extremo 3’.
 Diseño de Primers La diferencia
entre ambos
primers no debe
ser grande ni
mayor a los 5°C
 La secuencia debe ser altamente especifica para el gen de con respecto a la
interés  será la clave del éxito. del producto.

 Necesidad de diseño:
-Contenido de nucleótidos G-C  proporción del 40/60%.
-Longitud óptima  18 / 30 nt.

DETERMINANTES PARA LA TEMPERATURA DE FUSION

Temperatura a la cual 50% de los

Aumenta según la longitud de los
iniciadores se encuentran en
iniciadores  18/30 = 55/65°C
cadena lineal.
Diferencia entre
gADN y cADN
Esquema de la
PCR
 PCR convencional

I. Inicio de la desnaturalización.
II. Ciclos de amplificación:
-Temperatura de desnaturalización.
-Temperatura de alineamiento. Será necesario el uso
de un equipo llamado
-Temperatura de extensión. Termociclador

III. Amplificación temporal.

IV. Almacenamiento temporal.
 Termociclador
 Es capaz de cambiar la temperature de
la muestra en segundos.
 Calentamiento/enfriamiento por
resistencia electrica de una placa
metalica que distribuye la temperature
de manera homogenea durante tiempo
programados.
 Rango  4 a 96°C.
 Cuentan con una placa metalica a
manera de tapa la cual se mantiene a
103°C para evitar la condensacion del
agua en las tapas de los tubos donde
ocurre la reaccion con el fin de evitar
modificar la concentracion de solutos.
Pasos…
 Inicio de la desnaturalización:
95°C durante 5 minutos.

 Ciclos de amplificación (3 temperaturas diferentes):

1- 95°C durante 30 segundos  desnaturalización.
Al desnaturalizar permite el acceso a los primers a la cadena molde en sus
secuencias complementarias.

2- 55/60 °C durante 30/40 segundos  alineación.

Permite la hibridación de los iniciadores; se genera la energía cinética
necesaria para que estos busquen su secuencia complementaria y formen
puentes de hidrogeno.

3-72°C  extensión.
Temperatura optima para el funcionamiento de la ADNp
ATENCION: será variable de acuerdo a la ADNp que se utilice.
 Amplificación final
Se mantiene la temperatura de extensión por 5 minutos, lo que le da tiempo de
finalizar a la ADNp.

 Almacenamiento temporal.
4°C por varias horas  ciclo final.
Se conserva hasta el momento de retirar los tubos del equipo.
¿Con cuánto producto nos
quedamos?
 Teoricamente al final de cada ciclo la cantidad de ADN diana será
duplicado  por lo cual, al aumentar el numero de ciclos, aumentara
exponencialmente.
 Formula: Ejemplo 10 copias 25
P = (2)nt ciclos.
P numero de moleculas de producto.
P=(2)25.10
n numero de ciclos.
P=(2)250
t numero de copias iniciales.
P=1,8 x 10 75 moleculas
Protocolo
 Este protocolo está diseñado para la amplificación de fragmentos estándar que no
sobrepasan las 2 kb (dos mil bases). Es necesario seleccionar previamente la o las
regiones a amplificar así como seleccionar o diseñar los iniciadores, de acuerdo
con los objetivos de la investigación. Asimismo se deben establecer las condiciones
de amplificación de la PCR y las concentraciones de los reactivos.

Equipo
Termociclador•
Vortex•
Micropipetas de 2, 20, 100 y 200 µl•
Microcentrífuga•
Fotodocumentador•

Material
Guantes desechables de látex, vinil o nitrilo•
Tubos para PCR•
Puntas para micropipetas•
Baño de hielo•
Gradilla •
Reactivos
• Muestra de ADN que contenga la región(es) que se
desea amplificar
• Buffer o solución amortiguadora
• Cloruro de Magnesio (MgCl 2)
• Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
• Iniciadores
• Taq polimerasa
• Agua destilada o desionizada estéril

Método
1. Preparación de la muestra:
En un tubo para PCR se agregan los siguientes reactivos: el ADN molde, los
iniciadores, los nucleótidos o dNTPs, la solución amortiguadora, el cloruro de
magnesio (MgCl2), el agua y la ADN polimerasa, pueden agregarse otros compuestos
que ayudan a la estabilidad de la polimerasa.
1.a Mezclar los componentes de la reacción con un vórtex durante 2-3 segundos o
dando unos golpecitos con el dedo o invirtiendo el tubo varias veces (Stirling 2004).
1.b Centrifugar brevemente para reunir la mezcla en el fondo del tubo.
2.Amplificación:
Colocar las muestras en el termociclador programado con las condiciones de
amplificación establecidas previamente, por lo general se utilizan los siguientes
pasos:

2.a Desnaturalización inicial. Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de

desnaturalización (separación de la doble hélice porque los puentes de
hidrógeno se rompen), la temperatura y el tiempo se determinan de acuerdo a
las características del ADN y de la ADN polimerasa utilizada, por lo general es
entre 94 y 96 °C durante 5-10 minutos.

2.b Ciclos de la PCR. Se realizan ciclos sucesivos de desnaturalización,

alineamiento y extensión, generalmente estas etapas se repiten entre 25 y 35
veces.
2.2.a Desnaturalización. En esta etapa es muy importante que el ADN molde se
desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan
temperaturas de 94 ºC durante 30 segundos a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto
contenido de guaninas y citosinas, se recomienda aumentar el tiempo o la temperatura.
La actividad de la enzima decrece muy rápido a partir de los 95 ºC, por lo que a estas
temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.

2.2.2 Alineamiento. Al disminuir la temperatura de incubación los iniciadores se unen

al ADN molde en las zonas 3´complementarias. Ambos iniciadores se unen de manera
específica al ADN flanqueando el fragmento que se quiere amplificar. En este caso, la
temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los iniciadores:
la concentración, el número de bases y el porcentaje de guaninas-citosinas. En la
práctica, la temperatura de alineamiento oscila entre 45 y 65 ºC durante un tiempo
entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la
especificidad porque disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra
molde.
2.2.3 Extensión. Esta etapa, también conocida como elongación, amplificación o
polimerización, consiste en la síntesis de la nueva cadena de ADN, a partir del
extremo 3’ del iniciador por acción de la ADN polimerasa, empleando como
sustrato los cuatro dNTPs. En la mayoría de las reacciones, la etapa de
extensión se realiza a 72 ºC porque es la temperatura a la cual la Taq
polimerasa (enzima más utilizada) alcanza su mayor actividad. El tiempo de
extensión depende de la longitud del fragmento a amplificar, la Taq polimerasa
añade de 500 a 1000 nucleótidos por minuto.

2.3 Extensión final. Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una última
extensión de aproximadamente 5 minutos a 72 ºC para permitir que la
polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden haber
quedado incompletos.

3. Realizar electroforesis del producto obtenido.

 Modalidades

 PCR cualitativa.
 PCR semicuantitativa.
 PCR cuantitativa.
 PCR múltiple.
 PCR selectiva.
 PCR in situ.
 PCR anidada.
 PCR en punto final.
 PCR en tiempo real.
Con SyberGreen, con sondas taqMan, con primers Lux, con método 2DDct/ 2Act.