ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN

MAPAS DE RESTRICCIÓN Y
CLONACIÓN MOLECULAR
Realizado por: Biotecnología
Héctor Esteban Higuera Cogollo Docente:
Natalia Fernandez Velasquez
Ana Maria Garcia Cepero
 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas -las enzimas
endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras moleculares", cortando la
doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento
de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería
genética.

Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus
y degradan el ADN extraño. Ellas defenderán a la célula de la invasión cortando ese DNA
extraño en fragmentos y dejándolo no funcional.
 Qué son las enzimas de
Restricción?
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un
tipo de proteínas -las enzimas endonucleasas o enzimas de
restricción- que actúan como "tijeras moleculares", cortando
la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos
sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas
condujo a dichos microbiólogos al Nobel en 1978 y dio
origen a la ingeniería genética.

Las enzimas de restricción son producidas por bacterias

como método de defensa contra virus y degradan el ADN
extraño.Ellas defenderán a la célula de la invasión cortando
ese DNA extraño en fragmentos y dejándolo no funcional.
Clasificación de endonucleasas
Las endonucleasas se clasifican en 3 tipos de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III:

a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).

b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las
Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba
o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la
secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA,
desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Clasificación de endonucleasas
Tipo II:

a. Sólo tienen actividad de restricción.

b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la
secuencia que reconocen.
c. Sólo requieren Mg++ como cofactor.
d. No necesitan ATP.
 Secuencias palindrómicas

Una secuencia palindrómica, o

palíndromo, es una secuencia de ácido
nucleico (ADN o ARN) de 4-6 pb; que es lo
mismo si se lee de 5' (5-prima) a 3' (3-
prima) en un filamento o de 3' a 5' en el
filamento complementario, con el cual
forma una doble hélice. Son específicas
para cada enzima y son conocidas como
lugares de restricción
 Nomenclatura
Las endonucleasas se nombran a partir
de las bacterias de las que son extraídas,
según el género y la especie de la
bacteria de donde se aisló por primera
vez esta enzima.

Eco RI → E = género Escherichia

co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aisla-
da de esta cepa.
 Tipos de corte
Muchas enzimas de restricción hacen cortes escalonados que producen
extremos cohesivos de ADN de cadena sencilla. Sin embargo, algunos
producen extremos romos.
 DNA LIGASA
En la replicación del ADN, el trabajo de
la ADN ligasa es unir fragmentos de ADN
recién sintetizados para formar una
cadena continua.

Si dos fragmentos de ADN tienen

extremos complementarios, la ADN ligasa
puede unirlos para formar una molécula
sin interrupciones.
 Tipos de corte
Extremos …?

Extremos …?
 MAPAS DE RESTRICCIÓN
Un mapa de restricción representa una secuencia lineal de los sitios en los que
diferentes enzimas de restricción poseen dianas en una molécula de ADN
particular.

El DNA cortado (o digerido) se separa en un gel de agarosa y se determinan

los tamaños de los fragmentos mediante comparación con los tamaños de
moléculas conocidas (los "patrones") situadas en otra calle del gel.

http://biomodel.uah.es/an/plasmido/1/1-
restrict.htm
MAPAS DE RESTRICCIÓN
MAPAS DE RESTRICCIÓN
MAPAS DE RESTRICCIÓN
MAPAS DE RESTRICCIÓN
 CLONACIÓN MOLECULAR
Clonación es el proceso de duplicar un determinado gen, tejido o trozo de
ADN sin interacción sexual. Así, un clon es la copia genéticamente
idéntica de un organismo.
La clonación se produce naturalmente en algunas plantas y en células
unicelulares como las bacterias. En los humanos, los gemelos idénticos
se consideran clones naturales ya que comparten el mismo ADN. Fuera
de este último caso, la clonación es un proceso científico y, como tal,
persigue una serie de propósitos más amplios que la reproducción de
individuos idénticos.
TRANSFECCIÓN

Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado fundamentalmente para permitir la introducción de
ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la
regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares.
Podemos considerar dos grandes grupos de técnicas de transfección, los llamados métodos físicos (se basan en
el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los
métodos químicos.
También hay que decir que este conjunto de técnicas sólo es funcional in vitro, ya que es necesaria la exposición
de las células a medios extremos.
Podemos clasificar estos métodos en:
Métodos químicos
DNA desnudo
Liposomas
Métodos físicos
Electroporación
Microinyección
TRANSFECCIÓN Y TRANSFORMACIÓN

Los científicos usan las bacterias para todo tipo de estudios genéticos porque junto con los genes de
la bacteria pueden clonarse otros genes utilizando técnicas de transfección y transformación

Diferencias entre transfección y transformación Consiste en la introducción de material genético

externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de
transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término transfección para métodos no
virales se usa en referencia a células de mamífero, mientras que el término transformación se prefiere
para describir las transferencias no virales de material genético en bacterias y células eucariotas no
animales como hongos, algas o plantas.
 TIPOS DE CLONACIÓN SEGÚN EL OBJETIVO

○ Clonación reproductiva: La clonación reproductiva alude a la creación de individuos

genéticamente iguales. El embrión es implantado en el útero de una mujer, y se desarrolla
de manera completa en él. Como consecuencia adquiere un individuo idéntico al clonado,
sin que exista una relación sexual previa de por medio.
○ Clonación terapéutica: La clonación terapéutica se reduce a la etapa celular del
embrión, y el objetivo primordial es la elaboración de células madres. Éstas son capaces
de reproducirse ilimitadamente y son empleadas para tratar gran cantidad enfermedades.
TIPOS DE CLONACIÓN
La clonación de moléculas puede realizarse por dos procesos, la clonación acelular o la
clonación celular.

Acelular
Se conoce también como mecanismo de amplificación de ADN o ARN. Esta clonación puede
tener dos objetivos, obtener gran cantidad de ADN para distintos fines, o determinar la
secuencia de una porción pequeña de ADN en una disolución.
Su aplicación es muy variada. Se usa para detección de secuencias de ADN, para la
secuenciación de ADN, para rastreo de mutaciones, diagnóstico de enfermedades (parentales
o no), para estudios evolutivos, detección de células tumorales, amplificación de ADN para
clonación celular, etc.
 TIPOS DE CLONACIÓN
Celular

Este mecanismo utiliza células para clonar fragmentos de ADN, no es una clonación de células. Para ello, previamente
se ha tenido que amplificar (es decir, conseguir muchas copias clonadas) el ADN que se quiere clonar. Después, insertar
el ADN en vehículos, denominados vectores, que lo transportan e introducen en las células. El nombre que reciben estas
células es anfitriones, y son las células que hay que cultivar, es decir, conseguir multiplicarlas en un medio de cultivo.

Las células, cuando se multiplican, duplican el ADN propio y el fragmento que se desea clonar. De este modo se obtiene
un elevado número de células que contienen el ADN que se desea clonar, llamado recombinante.

El objetivo de este tipo de clonación puede ser la amplificación del ADN clonado con el fin de estudiar su secuencia, su
estructura, para estudios filogenéticos o para identificación de mutaciones. También se utiliza este método para estudiar
el mecanismo de regulación de los genes, su transcripción y su traducción. Otra aplicación está en la obtención de la
proteína que codifica la secuencia de ADN clonado, ya sea para analizar la estructura de la proteína, para alterarla o
comercializarla en función de sus propiedades. Ésta es la técnica utilizada para la obtención de insulina.
 DESVENTAJAS DE LA CLONACIÓN
Los problemas que plantea la clonación surgen a partir de la clonación molecular, clonación
de células y en la clonación de individuos.
La clonación molecular genera distintos tipos de problemas, dependiendo del método
empleado:
Para poder realizar la clonación acelular de moléculas es necesario conocer la secuencia de
ADN que queremos amplificar. Si esta secuencia no se conoce, no se puede realizar la
clonación.

Para poder realizar la clonación celular de moléculas es necesario realizar los siguientes pasos:
○ Conocer la secuencia de ADN que se quiere clonar.
○ Escoger un vector con suficiente eficacia como para insertar la secuencia de ADN.
○ Encontrar las células que han sido recombinadas por el vector.
○ Recoger el producto codificado por el ser clonado.
PASOS DE LA CLONACIÓN DE ADN
La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo la clonación de ADN se puede
utilizar para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:

1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que cortan el ADN) y
de ADN ligasa (que une el ADN).

Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en un plásmido. Con
ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:

● El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

● El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.

Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que
contenga el gen.
PASOS DE LA CLONACIÓN DE ADN
PASOS DE LA CLONACIÓN DE ADN

2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con antibióticos para identificar las bacterias que incorporaron
el plásmido.
Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros tipos de ADN en bacterias, como la
inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación, células bacterianas preparadas
especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que las anima a incorporar ADN extraño.
 PASOS DE LA CLONACIÓN DE ADN

3.Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como "fábricas" para producir la
proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y purificarla.
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado, podemos hacer crecer
un gran cultivo de bacterias que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal química
que les ordena producir la proteína blanco.

Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes cantidades de proteína. Por ejemplo,
si nuestro plásmido contuviera el gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el gen
y traducir el ARNm para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina humana.
 PASOS DE LA CLONACIÓN DE ADN
Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas
otras proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína blanco (la insulina en nuestro
ejemplo). Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o separada del resto del contenido de las células
con técnicas bioquímicas. La proteína purificada puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina,
administrarse a pacientes.
 CLONACIÓN ORGANISMOS
La técnica en animales consiste en conseguir células que contengan el gen responsable de la característica
deseada. Posteriormente, el núcleo de esa célula es insertado en un ovocito, del que previamente se ha extraído
su núcleo. Después hay que conseguir que esa célula diploide se divida formando un nuevo individuo, tal como lo
haría un cigoto formado por la fecundación del óvulo por el espermatozoide. Finalmente, para que desarrolle este
embrión, hay que implantarlo en el útero de una hembra.
Se puede modificar genéticamente el núcleo de la célula de un animal para, posteriormente, clonarlo. En este
caso, al ovocito al que se le ha extraído el núcleo se le inyecta el núcleo con la información genética modificada.

Lo que hicieron fue extraer una célula adulta de una oveja blanca y extirparle el núcleo. Tras esto, cogieron el
núcleo y lo insertaron en un óvulo de una oveja negra. Para llevarlo a cabo, previamente tuvieron que enuclear al
óvulo. Finalmente, mediante descargas eléctricas, consiguieron simular una fecundación. El “zigoto” fue
trasplantado al útero de otra oveja negra.
 BIBLIOGRAFÍA

1. Cuadro Cano BS, Vélez Castro MT, Infante Jiménez C. BIOTECNOLOGÍA: De la teoría a la
practica. Universidad de Cartagena. Cartagena; 2015.
¡Muchas Gracias!