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Tecnologia de Produção

de Vacinas
Apontamento histórico:

•Século XVIII: variolização (chineses)


As técnicas diferiam: algodão, com pó de crostas
ou pus inserido
no nariz, vestir roupas íntimas de doentes,
incrustar crostas em arranhões,
picar a pele com agulhas contaminadas, fazer
um corte na pele e colocar
um fio de linha infectado ou uma gota de pus.

•Edward Jenner (1796)


Cowpox
O mito das ordenhadoras imunes
Imunização de James Phipps pelas pústulas de
uma ordenhadora que possuía cowpox.
Inoculação com o pus varioloso.
Descoberta da vacina.
“vacalização”
•Louis Pasteur (1885)
Vacina anti-rábica
Imunização com as células da medula de um coelho infectado.
Desenvolveu imunizantes contra a cólera das galinhas e o carbúnculo do
gado.

Emile Roux e Alexander Yersin (1888)


•Descobriram que o bacilo da difteria produzia uma toxina poderosa,
responsável pelos sintomas da doença.
Em 1891, Emil Behring injetava doses subletais desta
toxina, provocando o aparecimento de moléculas antitóxicas (anatoxinas),
capazes de proteger contra a infecção e de ser transferidas para outros
animais, imunizando-os.

•E. Loewenstein e Alexander Glenny(1904)


Provaram que toxinas poderiam ser inativadas por substâncias químicas, no
caso formol, mantendo seu potencial imunizante, mas sem causar infecção.
Essa descoberta levou ao desenvolvimento dos primeiros toxóides:
diftérico e tetânico.
•Louis Sauer, Pearl Kendrick e Grace Eldering (1942)
Imunizantes contra coqueluche.
“Kendrick descobriu que sua vacina funcionava melhor na presença dos
toxóidesdiftérico e tetânico, combinou-os então para formar a vacina
DPT ou tríplice bacteriana – a primeira a imunizar contra mais de um
microorganismo.”

•Jonas Salk(1949)
Vacina a partir de vírus inativados (mortos). Foi o primeiro imunizante
no mundo a ser produzido em cultura de tecidos (células de rim de
macaco) e reunir mais de uma subespécie de vírus (poliovírus I, II e III).

•Albert Sabin(1954)
Vacina atenuada contra a pólio, a primeira a ser aplicada por via oral.
Por mimetizar o mecanismo de infecção do vírus selvagem, com a
excreção do microorganismo atenuado no ambiente, a vacina Sabin
facilita a obtenção de altos níveis de imunidade coletiva.
Principais desafios atuais para a imunização :

•Baixo interesse da indústria farmacêutica (vacinas representam apenas 2% do


mercado mundial)
•Labilidade dos produtos
•Risco da responsabilidade por reações adversas
•Alto custo de desenvolvimento
•Limitada capacidade de compra dos países alvos

Principais vantagens da imunização :

•Alto custo benefício para a saúde pública


Produção de vacinas
 Fase biológica (preparação de antígenos)
- Cultura de microrganismos
- Purificação
- Atenuação ou inativação
Produção de vacinas
 Fase farmacêutica
- Obtenção do produto final para utilização
Produção de vacinas
 Transporte e distribuição
 Cadeia de frio: Assegurar a estabilidade da
vacina em todas as etapas.
 Temperatura: 2°C a 8°C
Produção de vacinas
 Ciclo de produção: 6 a 22 meses
 70% do tempo total é ocupado pelo controle de
qualidade
 São necessários mais de 50 testes de controle
durante a produção de um lote de vacina
 14 dias para realizar um controle de esterilidade
Vacinas Bacterianas
 As vacinas bacterianas podem ser produzidas a
partir de:
- Microrganismos atenuados ou mortos
- Toxinas neutralizadas
- Componentes de cápsula, membrana ou parede
bacterianas
 Cultivo estático ou submerso
- Cultivo submerso: Bactérias mais resistentes à
liofilização
Os principais tipos de vacinas:
1- Vacinas vivas atenuadas

•Compostas de microrganismos vivos atenuados em laboratórios

• Capazes de multiplicarem-se no organismo hospedeiro

•Resposta imune ao microorganismo atenuado é idêntica a produzida pela infecção


natural

•O sistema imune é incapaz de diferenciar entre uma infecção pelo microorganismo


vacinal e o microrganismo selvagem.

•A multiplicação do microorganismo vacinal não costuma ser capaz de causar doença.


Vacinas vivas atenuadas: Sarampo, caxumba, rubéola, pólio, febre amarela,
varicela, BCG.

Métodos físicos de atenuação: Calor e radiação UV

Métodos químicos de atenuação:Formaldeído e Agentes alquilantes (β-propiolactona,


etieneimina)Ligam cruzadamente as cadeias de ácido nucléico

2- Vacinas inativadas

•Compostas de microrganismos inativados.

•Não mais se encontram vivos são incapazes de multiplicarem-se.

•Resposta imunológica limitada.

•Aplicadas em doses consecutivas

Exemplos de vacinas inativadas: DPT ,hepatite A, hepatite


B, raiva,meningococo, influenza, haemophilus do tipo-b, febre tifóide, cólera.
Vacina viva:
A primeira injecção permite ao vírus
multiplicar-se rapidamente, desencadeando
uma resposta imunitária em larga escala
com produção de anticorpos e resposta de
linfócitos T.
Prós e contras: Apenas é necessária uma
dose mas existe um risco mínimo de
desenvolvimento da doença.

Vacina morta:
Uma vacina morta não pode multiplicar-se e
a resposta dos anticorpos é limitada. Duas
injecções adicionais administradas
posteriormente asseguram uma produção
suficiente de anticorpos.
Prós e contras: Não existe risco de
desenvolvimento da doença, mas são
necessárias três injecções.
3. Vacinas de subunidades:
•As vacinas de subunidades usam apenas as partes do microrganismo para
estimularem o sistema imunitário.

•Ao conter apenas o que é necessário para uma resposta e não todas as outras
partes do microrganismo, as vacinas de subunidades tendem a causar menos
reacções adversas.

4. Vacinas de toxóides:
•Com algumas doenças bacterianas, tais como a difteria e o tétano, o problema
não são as bactérias propriamente ditas mas as toxinas que produzem.

•Em vez de conterem um antigéno microbiano, as vacinas de toxóides contêm


toxinas inactivadas, denominadas toxóides.

•Este tipo de vacinas estimula a produção de anticorpos. Quando uma pessoa é


infectada, estes anticorpos podem bloquear a entrada das toxinas nas células.
Vacinas Bacterianas
5. Vacinas recombinantes:

HEPATITE B
O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante o primeiro a ser
comercializado foi a vacina contra hepatite B.

“O primeiro passo é a seleção de um pedaço do


genoma do vírus, capaz de estimular o sistema de defesa do organismo,
mas não de infectar e causar a doença. Utilizando ferramentas da
engenharia genética, esta seqüência é inserida num microorganismo
não patogênico para o homem (no caso, o fungo Saccharomyces
Cerrevisae ou a bactéria Escherichia coli). Assim, o micróbio vetor
passa a expressar (produzir) uma proteína do vírus da hepatite B(antígeno de
superfície), provocando a formação de anticorpos.”
Metodologia tradicional de atenuação
Metodologia para produção de vacinas
recombinantes
Associação em leveduras:
Vacinas Vetorizadas:
Vacinas Virais
 Reprodução do vírus em cultura in vitro de células
animais ( ex: rim do macaco )
- Cultivo estático
- Cultivo submerso
Vacinas Virais
 Cultivo estático:
- Células crescem sem agitação até que toda a
superfície do meio fique coberta
- Inoculação do vírus
- Propagação
- Separação, purificação, inativação ou atenuação
do vírus
- Desvantagem: Maior risco de contaminação
Vacina Contra a Gripe
Multiplicação do vírus

Retira-se o líquido
que foi formado

Testes Limpeza e tratamento

Esta técnica pode ser utilizada para produção de outras vacinas virais, porém não é
usada para vacinas que são de origem bacteriana. Um ovo produz 1 dose de vacina
Vacinas Virais
 Cultivo submerso:
- Em biorreatores
- Agitação constante do meio
- Condições homogêneas
 Problemas:
- Células não se multiplicam livremente
- Acúmulo de subprodutos
Vacinas Virais
 Vantagens do uso de biorreatores:
- Produção em larga escala
- Redução de custos
- Maior eficiência na produtividade
- Condições ótimas (pH, T, O2 dissolvido)
- Maior uniformidade nos lotes de vacina
Vacinas Virais
Vacinas de DNA
 Objetivo: diminuição de efeitos colaterais e
problemas com crescimento de patógenos
Vacinas de DNA
 Fornece ao organismo hospedeiro a informação
genética necessária para que ele fabrique o
antígeno para geração de uma resposta imune.
 Representam uma metodologia que se aproxima da
infecção natural, alcançando a indução da
proteção desejada
 Produção em larga escala
 não necessita de uma rede de refrigeração
Objetivo
 Nesse trabalho é descrito um processo para a
produção de vacina humana do vírus H1N1 através
de células MDCK (Madin-Darby canine Kidneys) em
meio de cultura (DMEM) contendo soro, usando um
biorreator de leito recheado.
Materiais e Métodos
 Células
 MDCK células foram cultivadas:
 T=37°C
 Meiode Cultura: DMEN com alta concentração de glicose,
suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 3,7 g/L
de NaHCO3
Materiais e Métodos
 Vírus
A cepa do H1N1 foi repicada 3x nas células MDCK
contendo o meio DMEM sem FBS e com tripsina
 A produção de vírus foi medida pela titulação
expressa por unidade de hemagltinina viral(HA) ou
TCID50/mL
 O vírus foi armazenado em alíquotas de 10mL
(6,5x10^7 TCID50/mL) a -80°C
Materiais e Métodos
 Sistema rotativo de cultura e Frascos T
 As células foram descongeladas diretamente no frsco T-75
contendo DMEM com 5% de FBS.
 Depois de 3 dias uma parte foi transferida para frascos T-
150 (50ml) e foram cultivadas a 37°C em uma incubadora
de 5% C02
 Em um sistema rotativo (850cm2) culturas foram inoculadas
com 2.5x10^7 células e cresceram por 3 dias
 Quando havia 1,0-1,2x10^8 células, foram lavadas com
PBS 3x antes de adicionar o DMEM sumplementado com 2.5
um/mL de TPCK-treated tripsina
 A ação da tripsina com um volume equivalente de DMEM
com 5% de FBS
 A suspensão de células foi usada para inocular a cultura de
ACPB.
Materiais e Métodos
 Mini-Biorreator
 Ao AmProtein mini-biorreator (ACPB) self-rotatin foi
adicionado 0,6g de carriers de polimeros de fibra de
papel para otimizar as condições de crescimento
Materiais e Métodos
 Mini-Biorreator
 Estudo da relação entre densidade celular e GCR
 14 mini-bioreator
 6x10^6 células incubadas em 30ml de meio completo
 T=37°C com 5% de CO2
 Velocidade mantida a 45rpm
 O meio no mini-bioreator era trocado diariamente
 2 vasos eram removidos por dia para determinar
densidade celular e concentração de glicose
Materiais e Métodos
 Mini-Biorreator
 Determinação do efeito de diferentes concentrações de
MDCK
4 grupos foram testados contendo: 2x10^6 , 4x10^6,
6x10^6 e 8x10^6 células em 30ml de meio completo a
37°C e 5% de CO2.
 O meio de cultura foi trocado diariamente
 Cada grupo foi testado 2x e a média foi calculada
 Amostras foram retiradas do bioreator em intervalos de
12h durante o crescimento celular e a produção do vírus
Materiais e Métodos
 Otimização de parâmetros de infecção
 Determinar o efeito do inóculo e da Tripsina na
produção da vacina.
8 grupos contendo 2x10^6 células foram testados
1 2 3 4 5 6 7 8
Tripsina
(µm/mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 1,0 2,5 5,0 10,0

MOI 0,5 0,1 0,05 0,01 0,05 0,05 0,05 0,05

 Cada grupo foi testado 2x e a média foi calculada


 Amostras foram retiradas em intervalos de 24h durante o
crescimento celular.
Materiais e Métodos
 Cultura no ACPB
A coluna de perfusão foi preenchida com150g de
carriers, PBS (20mM, 6L) foi bombeado nela pela noite
 O PBS foi substituído pelo meio de cultura e as células
(5x10^8 celulas/L, 4L) do sistema rotativo de cultura
foram adicionados ao recipiente de alimentação,
transferido para a coluna de perfusão e incubado por
1h sem agitação.
Materiais e Métodos
 Cultura no ACPB
 Condições de operação do bioreatror:
 T=37°C
 Velocidade de rotação= 55rpm
 pH=7,4 – dissolvendo CO2 e 7,5% NaHCO3
 A taxa de circulação = 150mL/min
 O2 dissolvido foi mantido a 40% da saturação do ar,
dissolvendo ar e N2
Materiais e Métodos
 Cultura no ACPB
 Depois de 6 dias o meio de cultura foi removido e o
bioreator foi lavado 3x com 4L de PBS
 Vírus (MOI=0,05) em 10L de DMEM suplemendado
com 2,5µm/mL de Tripisina foram adicionados ao
bioreator
 Condições de operação na infecção e propagação do
vírus foram as mesmas do crescimento das células
MDCK com exceção da temperatura que foi mantida a
34°C
Materiais e Métodos
 Amostras e Análises
 Amostras do ACPB foram retiradas em intervalos de 12h
durante o cescimento celular e a produção do vírus
 Concentração de células e sua viablidade no sistema
rotativo e nos frascos T foram medidas usando o método
“Trypan Blue dye exclusion” com um hemacitómetro.
 Concentração de células no mini-bioreator e no ACPB foram
medidas usando crystal violet staining
 A concentração de glicose foi medida usando YSI 7100
 A titulação d HA foi feita em microplacas 96well com
células vermelhas do sangue de peru
 A concentração do vírus foi determinda com TCID50 nas
MDCK.
Resultados
 Expansão celular e preparação para a inocilação
no ACPB
Resultados
 Determinação de GCR on mini-bioreator
O crescimento celular foi proporcional ao GCR
Resultados
 Determinação de GCR on mini-bioreator
Resultados
 Otimização dos parâmetros de infecção no mini-
bioreator
Optimization of the
infection parameters in
mini-bioreactor
vessels. a Influence of
different MOI on virus
yield in the
minibioreactor
vessels: MOI
0.01(white), 0.05 (light
gray), 0.1 (gray), 0.5
(black).
Resultados
 Otimização dos parâmetros de infecção no mini-
biorreator

Influence of different
trypsin concentrations
(0, 1, 2.5, 5, 10
μg/ml) on virus yield in
the mini-bioreactor
vessels
Resultados
 Cultura no ACPB
Resultados
 Cultura no ACPB
Resultados
 Cultura no ACPB
Discussão
 A concentração de tripisina é um fator crítico para uma
produção eficiente de vacina de gripe a partir de células
MDCK
 A adição de 2,5µm/mL de tripisina no mini-bioreator apresentou
um aumento na produção do vírus em 3 dias
 A concentração do inóculo também é importante para a
produção eficiente de vacina de gripe a partir de células
MDCK
 Altos MOI aumentam a proporção de partículas sem vírus ou com
vírus não-infectuosos
 Baixo MOI diminue a produção do vírus
 Nesse estudo foi escolhido utilizar MOI=0,05 que corresponde
com a máxia produção de vírus no mini-bioreator
Discussão
 Nesse artigo foi apresentado um processo para a
predução de vacina para gripe usando meio DMEM
contendo soro(FBS) em um biorreator de leito recheado
(ACPB).
 O mini-biorreator foi usado para o estudo da relação
entre a densidade celular e GCR, além de estabelecer
parâmetros para a produção do vírus da gripe H1N1
 Depois da otimização o total de células aumentou de
2,0x10^9 para 3,2x10^10 depois de 6 dias.
 A utilização desse biorreator com “bolsas” discartáveis
dispensa a limpeza, diminuindo o tempo de operação o
que pode viabilizar o processo.