PROTEÍNAS

DE PRIMERA IMPORTANCIA
Gerardus Mulderr a sugerencia de Jons J. Berzelius (1838): “sin
duda el componente más importante de todas las substancias del
reino orgánico, sin ella la vida en nuestro planeta no existiría”.

Las proteínas son los componentes celulares mas abundantes.

Incluyen: enzimas, anticuerpos, hormonas, moléculas de transporte,
componentes del citoesqueleto, soporte mecánico, transmisores de
impulsos nerviosos y regulan el crecimiento y la diferenciación.

Son codificadas por el material genético.

Estructural y funcionalmente son las moléculas más diversas y

dinámicas y tienen un papel fundamental en casi todos los procesos
biológicos.
AMINOÁCIDOS EN PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS EN PROTEÍNAS
NOMENCLATURA
AMINOÁCIDOS POCO COMUNES
EN PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS NO ENCONTRADOS
EN PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS NO ENCONTRADOS
EN PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS NO ENCONTRADOS
EN PROTEÍNAS
AMINOÁCIDOS NO ENCONTRADOS
EN PROTEÍNAS
 PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
A pH 7 el grupo carboxilo pierde un protón mismo que gana el
grupo amino, por lo que si bien es neutro a este pH, está doblemente
cargado, llamándole ZWITTERION o iones bipolares, por lo que,
como otras substancias iónicas presenta elevados puntos de fusión
(300ºC), son altamente solubles en solventes polares.
PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
IONIZACIÓN
PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
IONIZACIÓN

OH– (equivalentes) OH– (equivalentes)

PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
VALORES DE pK
Nombre pK1 (αCOOH) pK2 (α-NH3+) pKR (grupo R)

Ácido aspártico 2.0 10.0 3.9

Ácido glutámico 2.2 9.9 4.3
Alanina 2.3 9.9 -
Arginina 1.8 9.0 12.5
Asparagina 2.0 8.8 -
Cisteina 1.8 10.8 8.3
Glicina 2.3 9.8 -
Glutamina 2.2 9.1 -
Histidina 1.8 9.1 6.0
Isoleucina 2.3 9.7 -
Leucina 2.3 9.7 -
Lisina 2.2 9.2 10.8
Metionina 2.2 9.3 -
Fenilalanina 2.6 9.2 -
Prolina 1.9 10.6 -
Serina 2.2 9.4 ~13
Tirosina 2.2 9.1 10.1
Treonina 2.1 9.1 ~13
Triptofano 2.4 9.4 -
Valina 2.3 9.7 -
PROPIEDADES ÓPTICAS DE
LOS AMINOÁCIDOS
Fórmulas geométricas

Proyección de Fisher

Imagen especular

L-gliceraldehído D-gliceraldehído

L-gliceraldehído L-α-amino ácido

 PROPIEDADES ÓPTICAS DE
LOS AMINOÁCIDOS

Rotación específica a 25°C, empleando la línea D del espectro del

sodio (589.3 nm)

Todos los aminoácidos, exceptuando a la glicina, son ópticamente

activos, ya que son capaces de desviar el plano de la luz polarizada,
llamándoles enantiómeros, los cuales son física y químicamente
indistinguibles con la mayoría de las técnicas.

TODOS LOS AMINOÁCIDOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS

PRESENTAN LA CONFIGURACIÓN ESTEREOQUÍMICA
L.
 ENLACE PEPTÍDICO

202= 400 dipéptidos

203= 8000 tripéptidos
20100= 1.27X10130 cadenas polipeptídicas
 ENLACE PEPTÍDICO
NOMENCLATURA

Valilglicilaspartilserilfenilalanilalanillisina

Terminación -ina cambia por -il, empezando por el extremo

amino terminal hasta el carboxilo terminal al cual no se le cambia el
sufijo.
 ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS

DEFINICIONES
La función de las proteínas solamente puede ser entendida en
términos de su estructura, esto es, la relación tridimensional entre sus
componentes.

ESTRUCTURA PRIMARIA: Secuencia de aminoácidos de la cadena

polipeptídica.

ESTRUCTURA SECUNDARIA: Arreglo espacial local.

ESTRUCTURA TERCIARIA: Estructura tridimensional del péptido

ESTRUCTURA CUATERNARIA: Arreglo espacial de las unidades

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

a) Detección de la proteína. Para purificar cualquier substancia,

debe existir la posibilidad de detectar cuantitativamente su presencia

I) Ensayo específico, sensible y sencillo

b) Selección de la fuente. Proteínas con función similar están

presentes en una variedad de organismos

I) Cantidad en el tejido o microorganismo

II) Facilidad para obtener mayor cantidad
III) Características para solubilizarla
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

c) Solubilización. Dependerá de las características mecánicas de la

fuente seleccionada.
I) Si es citosólica, solo habrá que romper la célula que la
contiene. LISIS OSMÓTICA CON SOLUCIÓN
HIPOTÓNICA (no sirve para células con pared celular).
II) Lisis de la pared celular con enzimas
III) Solventes orgánicos (acetona o tolueno)
IV) Ruptura mecánica (pulverizado, molido, homogeneizador,
prensa francesa, sonicador)
V) Si no es citosólica, habrá que solubilizarla (detergentes,
fuerza iónica, solventes), separar al organelo o disolviendo la
membrana
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

d) Estabilización. Una vez que la proteína ha sido removida de su

ambiente está expuesta a un sin numero de agentes que la dañan
irreversiblemente

I) pH II) Temperatura III) Proteasas

IV) Oxidación V) Metales pesados VI) Fuerza iónica
VII) Polaridad VIII) Crecimiento de microorganismos

e) Estrategia de purificación. En 1926 se cristalizó la primera

enzima, antes se pensaba que debido a su alto peso molecular eran
agregados coloidales. Hasta 1940 se habían purificado solo 20
proteínas.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

f) Estrategia de purificación. Las proteínas son purificadas

mediante métodos de fraccionamiento, por lo que el desarrollo de un
procedimiento eficiente de purificación es un reto intelectual y es
una tarea que consume mucho tiempo.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

f) Estrategia de purificación. Las características de las proteínas y

otras biomoléculas que se emplean en los diversos métodos de
separación son:

Característica Procedimiento
Carga Precipitación, Intercambio iónico,
electroforesis, isoelectroenfoque
Polaridad Cromatografía de adsorción, papel, fase-
reversa e interacción hidrofóbica
Tamaño Diálisis, filtración en gel, electroforesis,
ultracentrifugación
Unión específica Cromatografía de afinidad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS
a) Efecto de la concentración de sales. La solubilidad de una
proteína en solución acuosa, depende de la concentración de las
sales disueltas. La concentración de sales se expresa en fuerza
iónica = ½ Suma ciZi2. El grado de efectividad de los diferentes
iones es similar para las diferentes proteínas y se debe al tamaño
del ión y a la solvatación.

log solubilidad (g/ml)

log solubilidad (g/ml)

Fuerza iónica Fuerza iónica

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS
a) Efecto de la concentración de sales.
La solubilidad de una proteína a baja fuerza iónica generalmente
se incrementa con la concentración de sal, efecto denominado
“Salting in”, pero a altas concentraciones de sal, ésta compite
por el agua con la proteína, lo que hace que ésta última forme
agregados entre sí, provocando su precipitación, a éste efecto se
le denomina “Salting out”. Esta propiedad se emplea para llevar
a cabo una precipitación diferencial de las proteínas en una
mezcla, normalmente con Sulfato de amonio.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS
a) Efecto de la concentración de sales.
Adición de (NH4)2SO4 en g/l a 4°C
% final de saturación
% inicial de saturación
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS
b) Efecto del pH. La solubilidad de una proteínas están en función
del pH y se espera que sea mínima al pI de la misma, facilitando
así su precipitación, técnica que se denomina PRECIPITACIÓN
ISOELÉCTRICA.
Proteína pI
2.8 0.020 M
Pepsina <1.0
2.4 Ovalbúmina 4.6
Albúmina de suero (humano) 4.9
Solubilidad (mg N / ml)

Tropomiosina 5.1
2.0
Insulina (bovino) 5.4
0.010 M Fibrinógeno (humano) 5.8
1.6 γGlobina (humano) 6.6
Colágeno 6.6
1.2 Myoglobina (caballo) 7.0
Hemoglobina (humano) 7.1
0.8 0.005 M
0.001 M Ribonucleasa A (bovino) 9.4
Citocromo c (caballo) 10.6
0.4 Histona (bovino) 10.8
Lisozima (gallina) 11.0
4.8 5.0 5.2 5.4 5.8 Salmina (salmón) 12.1
pH
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS

c) Efecto de solventes orgánicos. Algunos solventes orgánicos

como la acetona y el etanol se emplean para precipitar a las
proteínas debido a su baja constante dieléctrica, lo que hace que
disminuya el poder de solvatación del agua para disolver iones
como las proteínas. Procedimiento que se lleva a 0ºC para evitar la
desnaturalización de las proteínas.

Otros solventes orgánicos miscibles en agua se emplean para

solubilizar algunas proteínas, debido a sus altas constante
dieléctricas, como el DMSO y la DMF.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS

d) Cristalización. Una vez que alcanzado cierto grado de pureza

con una proteína, puede ser posible cristalizarla, lo cual se hace
saturando la solución con la proteína, mediante el aumento paulatino
de la concentración del agente precipitante.

a) Azurina de Pseudomonas aeruginosa

b) Flavodoxina de Desulfovibrio vulgaris
c) Rubredoxina de Clostridium pasteurianum
d) Azidomet myo-hemeritrina de Siphonosoma funafuti
e) Hemoglogina de lamprey
f) Bacterioclorofila a de Prosthecochloris aestuarii
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

a) Filtración en gel.

Resina
porosa
1 2 3 4 5 5 7 8 9 10 11 12
Fracción No.

Vt = Vx + V0 Cantidad de soluto

V0 es normalmente ~ 35% del Vt Volumen de elución Ve Fracción No.

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

a) Filtración en gel. Nombre Tipo Rango de

fraccionamiento
(kD)
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.7
Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P-2 Poliacrilamida 0.1 - 1.8

Bio-Gel P-6 Poliacrilamida 1 - 6
Bio-Gel P-10 Poliacrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P-30 Poliacrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Poliacrilamida 5 - 100
Bio-Gel P-300 Poliacrilamida 60 - 400

Sepharosa 6B Agarosa 10 - 4000

Sepharosa 6B Agarosa 60 - 20000
Sepharosa 6B Agarosa 70 - 40000
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

a) Filtración en gel.

Peso molecular (kD X 103, escala logarítmica)

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

b) Intercambio iónico.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

b) Intercambio iónico.
Nombre Tipo de Grupo ioniozable
intercambiador

DEAE-Celulosa Catiónico -CH2-CH2-N(C2H5)2

DEAE-Sephadex Catiónico -CH2-CH2-N(C2H5)2

ECTEOLA-Celulosa Catiónico Mezcla de aminas

CM-Celulosa Aniónico -CH2COOH

CM-Sephadex Aniónico -CH2COOH

BioGel CM 100 Aniónico -CH2COOH

P-Celulosa Aniónico -OP3H2

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

b) Intercambio iónico.

Fuerza iónica

Volumen (ml)
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

b) Intercambio iónico.

Baja Alta concentración de sal

concentración
de sal

Cantidad de soluto

Cantidad de soluto
Baja Alta sal

Volumen de elución Ve

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fracción No.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad.
-Tipo de brazo
- El ligando debe presentar una afinidad relativamente alta por la
proteína de interés, pero no tanta que no sea posible liberarla.
- Si el ligando es substrato de la enzima ha ser aislada, las
condiciones cromatográficas deben ser tales que la enzima no lo
transforme.
- Una vez unida la proteína se lava la columna y se realiza la
elución con un compuesto que tenga mayor afinidad por el sitio
de unión al ligando, o por cambios en las condiciones de la
columna, como pH, fuerza iónica o temperatura.
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad.
-Activación y brazos
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad.
-Activación

Ligando
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad.

Proteína
de interés

Ligando

Ligando
acoplado
a la matríz

Fracción No. Fracción No.

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad. Ejemplos empleados

LIGANDO AFÍN A

5’ AMP Deshidrogenasas NAD+-dependientes

2’,5’ ADP Deshidrogenasas NADP+-dependientes
Calmodulina Enzimas que unen Calmodulina
Avidina Enzimas que contienen Biotina
Acidos grasos Proteínas que unen ácidos grasos
Heparina Lipoproteínas, lipasas, factores de coagulación,
DNA polimerasas y receptores de esteroides
Proteínas A y G Inmunoglobulinas
Concanavalina A Glicoproteínas
Poly(A) RNA con secuencias poliU
Lisina rRNA
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad. Ejemplo de una nucleasa

absorbencia
Absorbencia a 280nm

Actividad de nucleasa
Timidina
actividad

Ácido acético 0.1 M

pH 3.0

Derivado de difosfotimidina

Ve (ml)
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

c) Afinidad. Tabla de purificación de una proteína X

Procedimiento o Volumen Proteína Actividad Recuperación Actividad Veces de
paso de purificación específica purificación
(ml) (mg) (U) (%) (U/mg)

1. Extracto crudo 1,400 10,000 100,000 100 10 1.0

2. Precipitación con 280 3,000 96,000 96 32 3.2

(NH4)2SO4

3. Cromatografía de 90 400 80,000 80 200 20.0

intercambio iónico

4. Cromatografía de 80 100 60,000 60 600 60.0

filtración en gel

5. Cromatografía de 6 3 45,000 45 15,000 1,500.0

afinidad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

d) En papel. Ascendente y Descendente

Solvente
Jarra Muestra
distancia viajada por la substancia
Rf =
distancia viajada del frente del solvente

Soporte Soporte
Papel Papel
Frente del Frente del
solvente solvente
Muestra

Solvente
Solvente para mantener
la humedad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Ninhidrina
(sin color)

d) En papel. Dos dimensiones

Dirección de
flujo del
primer solvente Separación
si solo se
Origen Aldimina Cetiimina
empleara el
segundo solvente
Dirección
de flujo del
segundo
solvente
Ninhidrina

Amina intermediaria

Separación
empleando los
dos solventes

Púrpura de Ruheman

Ninhidrina

Separación Hidrindantina
con el primer
solvente
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

a) En papel. Por carga

Punto de
aplicación

Tira de papel

Iones Punto de Iones

negativos aplicación positivos
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por tamaño

Acrilamida Bisacrilamida
Persulfato

Radicales sulfato,
inician la polimerización
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por tamaño

Mezcla de
proteínas

Electroforesis
Dirección de la
electroforesis

Gel poroso
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por tamaño

M
u
e
s
t
Pozos r
Cátodo a

Placas

Anodo
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por tamaño

Pozos
Cátodo

Gel concentrador

Placas

separador
Ánodo
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por tamaño

1. Extracto crudo
2. Precipitación con sal
3. Cromatografía de intercambio iónico
4. Cromatografía de exclusión molecular
5. Cromatografía de afinidad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS
Sobrenadante Membranas

b) En gel. Por tamaño

Peso molecular (kD, escala logarítmica)

distancia viajada por la substancia
Rf =
distancia viajada del frente del solvente

Movilidad relativa (Rf)

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Por punto isoeléctrico (isoelectroenfoque)

pH ácido pH básico
(+) (-)

Anfolitas

pH ácido pH básico
(+) (-)
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS

b) En gel. Dos dimensiones

Isoelectroenfoque
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Tipos de centrífugas:
a) Analíticas b) Preparativas c) Flujo continuo

Por su velocidad:
a) Baja b) Media c) Alta
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Tipos de rotores:
a) Columpio b) Angulo fijo c) Verticales d) Casi verticales
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Características de los rotores:

Columpio Ángulo fijo Vertical

Después de la centrifugación
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Características de los rotores:

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Rotores de columpio
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Rotores de ángulo fijo

 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Rotores de verticales
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Cálculo de la Fuerza Relativa Centrífuga (x g)

Si r está en milímetros
g es la aceleración de la gravedad (9807 mm/seg2)

√
rpm 2 FRC
FRC= 1.12 r =xg rpm = X 1000
1000 1.12 r

x g se refiere a las veces que se ejerce la fuerza de la gravedad

sobre la partícula a determinada velocidad
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Cálculo del Factor de Clarificación (k)

ln (rmax/rmin) 1013
k= x
ω2 3600

Si se conoce el tiempo y factor de clarificación de una corrida

se puede emplear para calcular el tiempo equivalente en otro rotor

t 1 k2
t 1 k2 = t 2 k1 t2 = k
1
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN

Nomograma para el cálculo de x g o rpm

Distancia radial xg Velocidad del rotor

mm rpm
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación diferencial
Extracto
crudo

Centrifugación a baja velocidad (1,000 x g, 10 min)

Centrifugación a velocidad media (20,000 x g, 20 min)

Células completas Centrifugación a alta velocidad (80,000 x g, 60 min)

Núcleos
Citoesqueleto
Membrana plasmática
Mitocondria Ultracentrifugación (100,000 x g, 60 min)
Lisosomas
Peroxisomas
Microsomas Proteínas solubles
Vesículas pequeñas

Ribosomas
Virus
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad
Material Máximo de densidad
a 20°C

Sacarosa 66% 1.32

Sílica 1.30
Diodon 1.37
Glicerol 1.26
Cloruro de cesio 1.91
Formiato de cesio 2.10
Acetato de cesio 2.00
Cloruro de rubidio 1.48
Bromuro de rubidio 1.63
Formato de sodio 1.32
Bromuro de litio 1.83
Albúmina 1.35
Sorbitol 1.39
Ficoll 1.17
Metrizamida 1.46
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad
Menor Mayor
concentración concentración

Tubo

Gradiente
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad

Densidad (g/ml)

Radio (cm)
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad
Gradiente discontinuo Aplicación de la muestra

Jeringa de 5 ml

Aguja
Densidad Sacarosa
20 - 22
CsCl (%)
Adicionado
primero

Capa de
regulador
Muestra en
5% sacarosa
Gradiente
Adicionado
al último Gradiente de
sacarosa
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad

Muestra

Fuerza centrífuga
Fuerza centrífuga

Gradiente
de Partículas de
densidad diferente densidad

Mezcla de Con la fuerza

muestra y centrífuga
sustancia se forma el
formadora de gradiente
gradiente y se separan
las partículas
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación por tamaño y/o densidad o isopícnica

Gradiente de densidad Centrifugación

Muestra

Gradiente de
densidad

Componente Componente
de menor de mayor
densidad densidad
Fraccionamiento
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Coeficientes de centrifugación
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Coeficientes de centrifugación y peso molecular
Proteína Peso molecular Coeficiente de Sedimentación
(kD) (S)

Inhibidor de tripsina 6.5 1.0

Lipasa 6.7 1.14
Ribonucleasa A 12.6 2.00
Citocromo c 13.4 1.71
Mioglobina 16.9 2.04
Crotoxina 29.9 3.14
Concanavalina B 42.5 3.50
Toxina de la difteria 70.4 4.60
Citocromo oxidasa 89.8 5.80
Lactato deshidrogenasa H 150.0 7.31
Catalasa 222.0 11.20
Fibrinóheno 340.0 7.63
Hemocianina 612.0 19.50
Glutamato deshidrogenasa 1015.0 26.60
Proteina de la cápside viral 3013.0 48.80
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrifugación isopícnica

SW 65Ti; Suero humano, 0.2 ml (1%)

50,000 rpm; gradiente del 10%-40%; 65,000 rpm; gradiente del 10%-40%; 65,000 rpm; gradiente del 5%-20%;
16h; 5°C 16h; 5°C 7h; 5°C

Dirección de la sedimentación
 TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
TÉCNICAS DE CENTRIFUGACIÓN
Combinación de coeficientes de sedimentación y densidad

2.1

1.9
Densidad (g/ml)

1.7

1.5

1.3

1.1

Coeficiente de sedimentación (S)