MÉTHODES ANALYTIQUES

POUR ÉTUDES
TOXICOLOGIQUES

Marlène Lacroix
26/01/2012
ANALYTIQUE DANS LES ETUDES
TOXICOLOGIQUES

Evaluation de la contamination :
Source
Matrices environnementales (sols,
d’exposition air, eaux, aliments…)

Absorption Etude du contaminant et des ses

Distribution métabolites dans l’organisme :
Métabolisme Matrices biologiques (sang, tissus,
Elimination urines, fèces…)

Etude de biomarqueurs :
Effets Endogènes (Hormones, Acides
biologiques aminés, Lipides…) ou exogènes
dans matrices biologiques
2
LES TECHNIQUES ANALYTIQUES PRINCIPALES

Immunochimique Chromatographique
(Elisa, RIA, (HPLC, GC, CE)
Chemiluminescence)

3
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE : PRINCIPE
Principe basé sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps

2 méthodes de dosage :
 Réactifs en excès (dosage sans compétition)
 Réactifs limitant (dosage avec compétition)

Classification des méthodes de dosage :

Dosage avec Dosage sans compétition
Traceur
compétition
Radioimmunoassay Immunoradiometric assay
Radiomarqué
(RIA) (IRMA)
Enzyme-labeled
Enzymoimmunoassay
Enzyme immunosorbent assay
(EIA)
(ELISA)
Fluoroimmunoassay Immunofluorometric assay
Fluorescent
(FIA) (IFMA)
Luminoimmunoassay Immunoluminometric
Luminescent 4
(LIA) assay (ILMA)
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps

2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps

Anticorps

Autres Molécules
Molécules à doser

5
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION
Reconnaissance spécifique antigène – anticorps

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps

2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des
molécules non liées
Anticorps

Autres Molécules
Molécules à doser

6
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION

Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps

2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des
molécules non liées
Anticorps 5. Ajout d’un 2ème anticorps
Molécules à doser

Anticorps de détection

7
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION
Plaque 96 Puits

1. Introduction des anticorps

2. Introduction de l’échantillon
3. Liaison de la molécule
d’intérêt avec l’anticorps
4. Lavage, retrait des
molécules non liées
Anticorps 5. Ajout d’un 2ème anticorps
Molécules à doser 6. Lavage et retrait des
anticorps en excès
Anticorps de détection

L’anticorps de détection peut être radiomarqué ou fluorescent 8

DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION
Cas des dosages ELISA : Enzyme-Labeled ImmunoSorbent Assay

1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de

détection

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

9
PRINCIPE ELISA
1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de
détection
2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une
forme détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

10
Substrat
PRINCIPE ELISA
1. Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à l’anticorps de
détection
2. Un substrat de l’enzyme est ajouté et l’enzyme le converti en une
forme détectable (colorée ou fluorescente)

Anticorps

Molécules à doser

Anticorps de détection

Anticorps secondaire
lié à une enzyme

Substrat

Substrat converti

11
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION
Interprétation des résultats :

Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par

compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)

Dosage sans compétition :

Intensité du signal proportionnelle à la

concentration de la substance à doser

Réponse du signal
Domaine quantifiable

12
Concentration
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION

Anticorps (limitant)

Antigènes à doser 13
Antigènes marqués (en excès)
DOSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION
Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par
compteur de radioactivité : compteur β (H3…) , compteur γ ( I125…)

Dosage avec compétition :

Intensité du signal inversement

proportionnelle à la concentration de la
substance à doser

Réponse du signal
Anticorps (limitant) Domaine quantifiable

Antigènes à doser
Antigènes marqués (en excès)

14
Concentration
 MÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES :PRINCIPE
High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
Injecteur

Colonne Détecteur

A B

Pompes

15
Bille de silice greffée
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Polaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Apolaire Phase Polaire
directe
Détecteur

Chromatogramme

Intensité
16

temps
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Polaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Apolaire Phase Polaire
directe
Détecteur

Chromatogramme

Intensité
17

temps
UNE HISTOIRE D’AFFINITÉ …
Analytes Apolaires

Phase Phase
mobile stationnaire
Polaire Phase Apolaire
inverse
Détecteur

Chromatogramme

Intensité
18

temps
 DÉTECTEURS
Caractérisés selon leur sélectivité et leur sensibilité
Les plus répandus pour analyse de biomolécules: UV et Fluo

Faisceau lumineux à λ Émission de

dans ultraviolets la lumière

Excitation de
la molécule

Détection UV Détection Fluorescence

Limite de Limite de
quantification de quantification de
l’ordre µg/mL l’ordre ng/mL 19
Sensibilité x1000
Spectromètre de masse

Source Analyseur Détecteur

Séparation des Comptage des ions

Formation des charges ions m/z produits
Ionisation des molécules Amplification du signal

Ex: Trappe d’ion

Traitement
informatique
Ex: Electrospray Ex : Quadripôle
20
Source electrospray (ESI)
Ionisation des molécules en sortie de colonne

Cône

Sortie de
colonne

Sonde
electrospray

21
VERS L’ANALYSEUR…
Mesure le rapport m/z d’une molécule m = masse monoisotopique
z = charge

Exemple 1 : Aspirine (acide acétylsalicylique)

-
O OH O O

O CH3 Milieu basique O CH3

+ H+
O O

chargée <0 z=1

9 atomes de Carbone (mC = 12)

8 atomes d’Hydrogène (mH = 1) maspirine = 9 x12 +8 x1 + 4x16 = 180
4 atomes d’Oxygène (mO = 16) Abondance
relative %
179

Rapport m/z = 179/1 = 179

22
m/z
massif
isotopique
 Exemple 2 : Mesure le rapport m/z d’une molécule
R

Dérivé de vancomycine
H+
Formule : C80H87Cl3F3N11O24
Masse monoisotopique = 1750
Plusieurs sites basiques

Spectre de masse :

Chargé 2x
m/z = (1750+2)/2 = 876

Chargé 3x
m/z = (1750+3)/3 = 584
Chargé 1x
m/z = 1750+1 =1751 23
Exemple : Analyseur quadripolaire

quadripôle

24
Avec un triple quadripôle
Appareil de référence pour études quantitatives

Source Q1 Q2 Q3 Détecteur

Cellule de collision

Mode d’analyse
 « MS » simple
 « SIM » sélection d’ion
 « MS/MS » fragmentation
25
 « MRM » mode pour la quantification
 Mode d’analyse
ions

Q1 Q2 Q3

Les quadripôles laissent passer tous les ions

- Spécifique

‫ « ס‬MS » simple
 « SIM » sélection
Applications d’ion :
en bioanalyse
 «Études
MS/MSde » fragmentation
pureté

 MRM » mode (concentration

«Quantification de l’ordre du
pour la quantification
µg/mL) 26

+ Spécifique
 Mode d’analyse
ions

Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini

- Spécifique

 « MS » simple
 « SIM » sélection d’ion
« MS/MS » en
Applications fragmentation
bioanalyse :
 « Quantification
MRM » mode pour la quantification
Concentrations µg/mL 27
Screening de molécules
+ Spécifique
 Mode d’analyse
Énergie de collision : gaz inerte (argon)
Ions
Ions « fils »
Ion
« père »
Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini

Fragmentation dans le deuxième quadripôle
- Spécifique Passage des ions fils dans le troisième quadripôle

 « MS » simple
« MS/MS » fragmentation
« SIM » sélection
Applications d’ion :
en bioanalyse
« MS/MS
Études » fragmentation
structurales(métabolomique,
protéomique…) 28
 « MRM » mode pour la quantification
+ Spécifique Quantification (+ sensible que MS ou SIM)
 Mode d’analyse
Énergie de collision : gaz inerte (argon)

Ions
Ion Ions
« père » « fils »
Q1 Q2 Q3

Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini

Fragmentation dans le deuxième quadripôle
- Spécifique Sélection d’un ion fils dans le troisième quadripôle

 « MS » simple
Applications en bioanalyse :
 «Quantification
SIM » sélection d’ion
Concentrations ng/mL
 «Screening
MS/MS » fragmentation
de molécules
29
 « MRM » mode pour la quantification
+ Spécifique
 Couplage LC/MS

Spectromètre de masse utilisé comme détecteur

Chromatogramme
Intensité

Temps
Σ Spectres de masse
Abondance relative %

30

Rapport m/z
AVANTAGES – INCONVÉNIENTS

Immunochimie Chromatographie

 Méthodes rapides
 Méthodes sensibles
 Méthodes sensibles
 LC/MS spécifique
 Forte capacité
 Dosages de plusieurs
d’échantillon
molécules en une analyse
 Utilisation facile

 Purification échantillon
 Pas toujours sélectives
nécessaire
 Dosage 1 molécule à la
 Durée analyse
fois
 Coût appareillage élevé
 Elaboration difficile

31
APPLICATION : ÉTUDES TOXICOCINÉTIQUE/TOXICODYNAMIE

Toxicocinétique Toxicodynamie

Dose Réponse
Profils de biologique
concentration

Etudes de
Quantification du biomarqueur
contaminant (et
métabolites) 6 1000
10000

10000 1000

100

10
1000
1 4 100
Concentration (ng/mL)

0 6 12

100

10
2 10
1

0
0 50 100 150 200 250 300 0 1
Time (h)

44 46 48 50 52 54 56 58

Administrati
Collecte Analyse
on Toxicodynamie
Toxicocinétique

32
ADMINISTRATION
 Produit chimique, produit naturel isolé, etc.
 Choix d’un solvant d’aministration
 Documenter la stabilité du produit
 Attention aux substances peu solubles
 Verifier les doses administrées (analytique)
 Produit de formulation
 Essai pilote
 Doses commerciales (produits pharmaceutiques)
 Peu être inexacte
 Impuretés (± 5%)
 Se référer à la directive pour les produits pharmaceutiques Good
Manufacturing Practice (GMP)
 Vérifier les doses administrées (analytique)
 Mode d’administration
 Perfusion, Bolus….
 Doses simples, multiples
 Voie d’administion (IV reference, orale….)
33

A définir dans le protocole expérimental

STRATÉGIE DE PRÉLÈVEMENT

Pour chaque spécimen collecté il faut garantir :

 Un bon prélèvement
 Ponction ou cathéter (prélèvement sanguin)
 Site de prélèvement (veine, artère…)
 Temps de prélèvement (durée, cycle circadien, …)
 Un bon traitement ou préparation des spécimens
 Sang total, plasma, serum…
 Tubes de collecte (anticoagulant, type de tube…)
 Conditions de centrifugation
 Filtration (urines)
 Une bonne conservation pour s’assurer de la stabilité des
substances et de leurs métabolites
 Température de conservation (-20°C, -80°C…)
 Durée de conservation avant analyse

34
A définir dans le protocole expérimental
ANALYSE ET VALIDATION DE MÉTHODES
10000

10000 1000

100

10
1000
1

Concentration (ng/mL)
0 6 12

Valeurs des concentrations les plus fiables possibles

100

10

0
0 50 100 150 200 250 300
Time (h)

PARAMÈTRES FONDAMENTAUX
 Sélectivité/spécificité
 Linéarité
 Exactitude
 Précision (répétabilité/reproductibilité)
 Sensibilité
 Stabilité

Certifie que la méthode est appropriée pour une utilisation routinière

Texte de Référence :
Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department
of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for 35
Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine
(CVM), May 2001
SÉLECTIVITÉ/SPÉCIFICITÉ

Définitions :
Sélectivité : Capacité à différencier et quantifier un analyte en présence d’autres
substances dans la matrice
Spécificité : Propriété de la méthode analytique de convenir exclusivement à
l’analyte avec la garantie que le résultat ne provient que de l’analyte. (absence
interférence)

Exemple :

Aire à LOQ
Réponse

Aire interférence < 5% LOQ

36
T (min)
Linéarité : courbe de calibration
Définition : Rapport entre les concentrations connues et les réponses
analytiques expérimentales (observées).

Objectif : Déterminer les concentrations des échantillons

Chromatogramme :
Analyte

SI

37
 Utiliser un standard interne et utiliser le
ratio :
Origine de l’erreur : Précision et exactitude

o Erreur systématique (non aléatoire)

 Biais
 Impossible de le corriger
C’est l’exactitude (accuracy)
o Erreur aléatoire
 On peut l’évaluer avec des statistiques
C’est la précision

Illustration avec des cibles

38
Méthode précise et Méthode peu Méthode précise et Méthode peu
exacte précise et exacte biaisée précise et biaisée
Mesure de l’exactitude

o L’exactitude d’une méthode analytique est l’étroitesse de l’accord entre la

moyenne d’une série de concentration obtenue par le modèle et la
concentration réelle de l’analyte.

 Points QC « Quality Controle »

 5 QC à 3 niveaux de concentrations:
(Bas (3*LOQ), Milieux, Haut)

o Comparaison entre moyenne des concentrations calculées et valeur théorique

Moy Cpréd - Cnom
Exactitude (%) = 100 x +100 39
Cnom

Critères d’acceptabilité85
: % < Exactitude <115 %
 Mesure de la précision
o La précision d’une méthode analytique mesure l’écart de chaque mesure
individuelle par rapport à la moyenne des mesures d’un volume d’échantillon
unique et homogène

 Points QC « Quality Controle »

 5 QC à 3 niveaux de concentrations
 Précision intra-jour (répétabilité)
 Précision inter-jour
(reproductibilité)
 Evaluation sur 3 jours
 Calculée avec le coefficient de
variation (CV%)
X1 X2
Écart type
CV % = X 100
Moyenne

o Pour une précision intra-jour et/ou inter-jour sur plusieurs concentrations :

Analyse de variance (ANOVA)
40

Critères d’acceptabilitéCV
: < 15 %
Sensibilité : LOD et LOQ
Définition :
o la limite de détection (LOD) est la plus petite concentration de l’analyte
pouvant être détectée et différencier du bruit de fond. En général, elle est
évaluée à 3 x le bruit de fond du signal.

o la limite de quantification (LOQ) est la plus petite concentration de

l’analyte pouvant être quantifiée avec une exactitude et une précision
appropriée.
Domaine d’analyse :

LOD LOQ

Non LOD
Domaine Domaine
détectable détectable quantifiable

Mesure de la LOD :
 Injection de six blancs matrices et mesure de la réponse
 Calcul de la concentration en retour moyenne x 3 = LOD
Mesure de la LOQ :
41
 Injection de 5 points de LOQ et calcul des concentrations
 Critère d’acceptabilité : CV < 20 % et exactitude entre 80 et 120 %
Stabilité
La stabilité de l’échantillon doit être évaluée à toutes les étapes
précédent l’analyse.

Critère d’acceptabilité :
Il n’y a pas de valeurs réglementaires

On s’autorise une
 Stabilité des solutions mères et filles variation de 5%

 Stabilité à cours terme

 Stabilité à long terme

On s’autorise une
 Cycle de congélation-décongélation variation de 15%

 Stabilité post – extraction

42
Dosage en routine

Chaque jour de dosage :

 1 gamme + 2 séries de QC à trois niveaux de concentrations par jour.

 1 série valide la gamme du jour et une série en fin de dosage valide les
échantillons

Critère d’acceptation :
 75% des points de la gamme doivent avoir une variation ± 15% par rapport
à leur valeur nominale (sauf à la LOQ ± 20%)
 2 QC sur 6 QC peuvent être au-delà de ±15% de variation (mais pas au
même niveau de concentration)

43
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Fipronil : Insecticide à usage phytosanitaire ou vétérinaire

F O N
F S

F
N
H2N
N
Interdit en France en 2004
Cl Cl
Substance vétérinaire la
plus commercialisés au
F F
monde
F

Métabolite principal : Fipronil sulfone (-SO2CF3)

Potentiel perturbateur endocrinien : Effet sur hormones thyroïdiennes

Risque pour la santé humaine lié à l’exposition au fipronil?

44
 EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Objectif : Evaluer les effets du fipronil et de son métabolite sur les hormones
thyroïdiennes
Toxicocinétique Toxicodynamie
Dose Réponse
Profils de biologique
concentration

Protocole : Gavage 14 jours

Fipronil
Fipronil sulfone
Administration Solvant
IV ou VO Dosage Fipronil Administration
Fipronil et métabolite par IP Dosage T4
Fipronil sulfone LC/MS Thyroxine (T4) à par RIA
Plasma Plasma
Solvant chaque groupe
6 jours (IV) 24H
9 jours (VO) 8 pts/cinétique
10 pts/cinétique
Réponse biologique :
IV : Paramètres TK Clairance et métabolisme T4
(t1/2, CL…)
Rats THX + T3 (SC) VO : Dosage T4 et
Cathétérisés Biodisponibilité métabolites par
LC/MS 45
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TK : A: voie intraveineuse B: voie orale

Fipronil Fipronil

400 Fipronil 400 Fipronil

fipronil et fipronil sulfone (ng/mL)

Concentrations plasmatiques en
Concentrations plasmatiques en

fipronil et en fipronil sulfone

300 300

(ng/mL)
200 200

100 100

0 0
0 25 50 75 100 125 150 0 40 80 120 160 200 240
Temps (h) Temps (h)

Fipronil sulfone Fipronil sulfone

400 Fipronil sulfone 400 Fipronil sulfone

fipronil et fipronil sulfone (ng/mL)

fipronil et fipronil sulfone (ng/mL)

Concentrations plasmatiques en
Concentrations plasmatiques en

300 300

200 200

100 100

0 0
0 25 50 75 100 125 150 0 40 80 120 160 200 240 46
Temps (h) Temps (h)

Fabs ≈ 1 quelque soit la molécule

EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TD (dosage RIA) :
80 Solvant 1 A: T4 totale
*
Fipronil *

Clairance de la TT4 (mL/min/kg)

Concentrations plasmatiques en TT4

Fipronil sulfone
60 0.75
* P < 0.05
** P < 0.01

40 0.5
(ng/mL)

20 0.25

0 0
0 5 10 15 20 25 Solvant Fipronil Fipronil sulfone
Temps (h)
**
30 Solvant 4500 B: T4 libre
**
Fipronil
Concentrations plasmatiques en FT4

Clairance de la FT4 (mL/min/kg)

Fipronil sulfone 3600

20 * P < 0.05
2700 ** P < 0.01
(pg/mL)

1800
10

900

0 47
0
0 5 10 15 20 25 Solvant Fipronil Fipronil sulfone
Temps (h)
EXEMPLE : ETUDE TOXICOLOGIQUE DU
FIPRONIL
Résultats TD (dosage LC/MS) :
Permet de doser la T4 et ses métabolites
Concentrations plasmatiques (ng/mL)

Concentrations plasmatiques (ng/mL)

120 T4 7 T3 Dernière SC T3
Solvant
100 6
Fipronil 5
80
Fipronil 4
60
sulfone 3
40
2
20 1
0 0
0 10 20 30 0 5 10 15 20 25
Temps (Hr) Temps (Hr)
Concentrations plasmatiques (ng/mL)

2
T2 Modification du profil de la T4 et de
ses métabolites en présence de
Fipronil ou de Fipronil Sulfone
1

0
0 5 10 15 20 25
Importance d’évaluer les molécules 48
mères mais aussi les métabolites formés
Temps (Hr)