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TINA TJEEGA KADAL JEAN PIERRE

DOCTORANT EN PHARMARCIE
13M144
FMSB-YDE1
SOMMAIRE

INTRODUCTION
 QUESTION DE RECHERCHE
HYPOTHESE DE RECHERCHE
OBJECTIFS
GENERALITES SUR VERNONIA CONFERTA
MATERIEL ET METHODOLOGIE
RESULTATS ATTENDUS
CHRONOGRAMME
BUDGET
INTRODUCTION

• L'avènement de la multirésistance des bactéries pathogènes met en


péril la valeur des antibiotiques, qui ont déjà transformé les sciences
médicales.
• Des efforts considérables sont nécessaires pour minimiser le rythme
de la résistance en étudiant les micro-organismes émergents, les
mécanismes de résistance et les agents antimicrobiens
• Des approches de rechange progressives, y compris les probiotiques,
les anticorps et les vaccins, ont donné des résultats prometteurs dans
des essais qui suggèrent le rôle de ces solutions de rechange comme
traitements préventifs ou d'appoint dans l'avenir
INTRODUCTION

Dans notre étude, nous nous proposons d’étudier les propriétés


antimicrobiennes de Vernonia Conferta

Evaluer les propriétés antimicrobiennes de V.conferta en association


à un autre antibiotique sur des souches de bactéries multi résistantes
aux antibiotiques conventionnels
HYOTHESE DE RECHERCHE

• Les extraits aqueux et hydroéthanoliques de V.conferta auraient des


propriétés antibactérienne.
OBJECTIF GENERAL

• Evaluer les potentielles activités antimicrobiennes des extraits aqueux


et hydroéthanoliques de V.conferta sur des souches de bactéries
multi résistantes aux antibiotiques conventionnels.
OBJECTIFS SPECIFIQUES

Déterminer les constituants phytochimiques de la plante vernonia


conferta
 Évaluer l'influence de la fermentation sur les activités
antibactériennes des extraits de vernonia conferta
Comparer les activités des extraits végétaux avec celles d'un
antibiotique conventionel
Evaluer l’influence de l’association des extraits de vernonia conferta
avec un antibiotique conventionnel
GENERALITES SUR VERNONIA CONFERTA

• Règne Plantae
• Phylum Tracheophyta
• Classe Magnoliopsida
• Ordre Asterales
• Famille Asteraceae
• Genre Monosis DC
• Espèce Vernonia conferta Benth.
USAGES ETHNOBOTANIQUES
• Douleur
• Infections bactériennes
• Thérapie du cancer
• Diabète
• Infections helminthiques
• Hépatotoxicité
• Maladies inflammatoires
• Améliorateurs de mémoire
• Maux d'estomac
• Diarrhée
DESCRIPTION

• Dimensions (mm) 3-5*


• Couleur extérieure Noir vert
• Couleur intérieure Marron foncé
• Texture résistante
• Plan de fissure Fibreux
• Odeur de la poudre Distinct, âcre
L'analyse de la composition phytochimique a révélé la présence
d'alcaloïdes, de tanins catéchiques et de terpénoïdes dans l'écorce du
tronc de Vernonia conferta
MATERIEL ET METHODOLOGIE

Description de l’étude : étude expérimentale


Sites de l’étude:
• Laboratoire de chimie organique porte 278 de la Faculté des sciences de
l’Université de Yaoundé 1: extraction et screening phytochimique
• Laboratoire d’hydrobiologie et Environnement du département de Biologie
et Phsiologie Animales de la Faculté des Sciences de l’Université de
yaoundé I: Determination de l’activité antibactérienne des extraits aqueux
et hydro-éthalonique de V.conferta
Durée de l’étude: Novembre à Mai 2020
• la phase expérimentale de Janvier –Avril 2019
MATERIEL

• Matériel végétal
Le matériel végétal sera constitué des écorces et des tiges de
Vernonia conferta Benth qui seront récoltées au mois de octobre 2019
à Baffousam dans la région de l’ouest Cameroun. Les échantillons
récoltés seront identifiés à l’Herbier National du Cameroun.
MATERIEL

• . Microorganismes
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons des souches
bacteriennes de aeromonas hydrophila, pseudomonas aeruginosa,
vibrio cholerae, staphylococcus aureus, Il s’agira de souches de
bactéries Gram négatifs . Ce sont par ailleurs des bactéries
responsables des multirésistances
MATERIEL

• Appareils
L’évaporateur rotatif (de marque précise), lyophylisateur(de
marque précise), la balance, L’autoclave (de marque précise et de
model précis), le poupinel (de marque précise et de model précis), le
bec bunsen, le distillateur (de marque précise et de model précis),
l’incubateur (de marque précise et de model précis) et la centrifugeuse
(de marque précise et de model précis) seront utilisés pour la
détermination de l’activité antimicrobienne
MATERIEL

• Réactifs et solvants
Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et l’eau physiologique seront
utilisés dans la détermination de l’activité antimicrobienne. La
réalisation du screening nécessitera plusieurs réactifs et solvants : le
réactif de valse Mayer (1,36 g de HgCl2 et 5 g de KI pour un volume final
de 100mL) ; le réactif de Hager (solution saturé d'acide de picrique) ; le
réactif de Wagner (1,27 g de I2 et 2 g de KI pour un volume final de 100
mL) ; une solution diluée de perchlorure de fer (FeCl3) ; l’acétate de
plomb à 10 %; l’anhydride acétique; l’acide sulfurique; le chloroforme;
MATERIEL

• Réactifs et solvants
l’acide acétique anhydre; le NaOH 2N; l’acide sulfurique
(concentré et à 10 %) ; le NH4OH dilué au demi ; l’alcool chlorhydrique
(alcool à 95° + eau distillée + HCl concentré à partie égale en volume) ;
les copeaux de magnésium; l’alcool iso-amylique; l’acide chlorhydrique
à 1 %; le FeCl3 10 %; une solution de sulfate de cuivre 1 % (1 g de CuSO4
en solution ajouté à 65 mL d’eau ; distillée que l’on agite fortement et
complète à 100 mL) ; l’éthanol absolu; le réactif de STIASNY (10mL de
formol à 40 % plus 5 mL d’HCl concentré) ; le HN03 et l’ammoniaque.
MATERIEL

• Verrerie
La balance à précision 0,1 près, les béchers, les erlenmeyers, les
portoirs, les tubes à essai, les pipettes de 5 et 10 mL,
entonnoirs,burette, pissette, serviront à la fois pour l’extraction, le
screening phytochimique et la détermination de l’activité
antimicrobienne. Les pipettes pasteurs, les micropipettes de 15 μL, 100
μL, 1000 μL et embouts de 100 μL, 1000 μL, les tubes à essais à vis, les
écouvillons, les boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre, les disques
stériles de 6 mm de diamètre, l’anse de platine, pied à coulisse seront
spécifiques à la détermination de l’activité antimicrobienne.
• Milieux de culture
• aeromonas hydrophila
 Culture sur milieux de type gélose au sang :
 Milieux spéciaux : Mac Conkey, Drigalsky, CIN
• pseudomonas aeruginosa
Culture sur milieux de type gélose au sang
Milieux spéciaux : Milieu au cétrimide ou CETAVLON® (bromure de N-cétyl N,N,N,-
triméthylammonium) +/- acide nalidixique : PSEUDOGEL®, PYOCYANOSEL®
• Milieux de culture
• vibrio cholerae
Culture sur milieux de type gélose au sang
Milieux spéciaux : Milieu d'enrichissement : eau peptonée alcaline, milieu
taurocholate tellurite peptone.
Milieu d'isolement :
- peu sélectif : gélose nutritive avec 0,1 % de Teepool ;
- sélectifs : milieu TCBS.
• staphylococcus aureus
Culture sur milieux de type gélose au sang
Milieux spéciaux : Milieu sélectif de Chapman à 7,5% de Na Cl (milieu
hypersalé + mannitol) et milieu de Baird-Parker au tellurite (colonies
noires avec halo clair)
METHODOLOGIE 1000g de poudre d’ecorse/ 1000g de
poudre de tiges de V.conferta

Macération de 1000g chacun


pendant 48hrs et une seconde
Eau distillé la macération a été effectuée Ethanol
pendant 24 heures

Filtrer et Filtrer et
concentrer par concentrer par
lyophilisation évaporation sous
rotavapeur

Extrait aqueux en Extrait


grammes Analyses physico- éthanolique en
chimiques et évaluations grammes
antibactériennes
METHODOLOGIE

• Évaluation antibactérienne in vitro


• Les activités antibactériennes seront évaluées à l'aide des disques en milieu
gélosé et du frottis jusqu'à ce que la surface de la gélose ait été épuisée.
• Les effets de ces activités seront en outre déterminés par l'utilisation de
différentes quantités/concentrations tout en variant la température et le
type de récipients dans lesquels elles seront stockées
• L'activité antimicrobienne sera évaluée par la détermination de deux
paramètres : la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la
concentration bactéricide minimale (CBM). Le matériel sera lavé au
préalable, bouché avec du coton hydrophile et stérilisé à l’autoclave à
121°C pendant 30 minutes.
METHODOLOGIE

• Préparation des milieux de culture


Les milieux de culture, à savoir de type gélose au sang et milieux
spéciaux, seront préparés et stérilisés dans l'autoclave à 121℃ pendant
15 minutes selon les recommandations du fabricant
METHODOLOGIE

• Préparation de solutions d'extraits et d'antibiotiques


Des solutions d'extrait seront préparées à différentes concentrations
(1000µL/mL). Chaque solution sera préparée avec de l'eau
physiologique stérile.
Nous préparerons également la solution antibiotique principale et
l'utiliserons comme contrôle positif.
Chaque solution préparée sera d'abord filtrée sur du coton hydrophile,
puis sur une membrane filtrante à porosité de 0,45 µm.
METHODOLOGIE

 préparation de l’inoculum bactérien

suspension bactérienne
Ensemencement sur à 10^6 UFC/ml
milieu approprié
1-3 colonies

Incubation Vortex et dilution


Souche bactérienne à Colonies
24h/37°c au 1/100ème
tester jeunes, isolées
25
• Détermination du diamètre d'inhibition en milieu gélosé (essais de
sensibilité)
• Principe : Disques de cellulose imprégnés d'une certaine quantité
d'antibiotique placé dans une gélose qui a été préalablement étalée avec
une souche bactérienne à tester.
• L'antibiotique diffusé dans la gélose, avec un gradient de concentration
décroissant par rapport au disque périphérique. Après incubation entre 18-
24hrs sur 37℃, les zones d'inhibition de la croissance bactérienne seront
mesurées pour chaque disque. Plus le diamètre est grand, plus la sensibilité
de la bactérie à l'antibiotique est grande[43] .
• La sensibilité des taches bactériennes aux extraits végétaux sera évaluée en
fonction de leur diamètre d'inhibition connu par mesure avec un étrier de
Vernier.
• Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
• La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) sera fondée sur
l'évaluation de la sensibilité d'un micro-organisme à une substance
antimicrobienne. C'est la plus petite concentration qui peut inhiber toute
croissance visible d'un micro-organisme après incubation à 37°C pendant 18 à 24
heures en utilisant la technique du frottis.
• Par la suite, le diamètre d'inhibition sera mesuré à l'aide d'un étrier de Vernier de
tous les différents plats. la sensibilité aux différents extraits en fonction du
diamètre d'inhibition est classée comme suit
• Moins de 8 mm (non sensible)
• Entre 9-14mm (Sensible)
• Entre 15 et 19 mm (très sensible)
• Supérieur à 20mm (Extrêmement sensible
METHODOLOGIE

Lecture d’un pied à coulisse (EUCAST, Août 2013)

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METHODOLOGIE
Traitement et analyses des données

Données saisies - représentations graphiques réalisées dans le


tableur EXCEL version 2010

Vérification de la normalité de distribution des données - Analyse


des variances (ANOVA) - Comparaison des moyennes des
échantillons - Logiciel SPSS version 21.0

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RESULTATS ATTENDUS

• Criblage phytochimique
La présence des métabolites secondaires sera révélée par la positivité des
tests effectués selon les principes décrits par les auteurs.
• Effet sur l'activité antibactérienne
Nos extraits seront considérés comme ayant un effet positif sur
l'activité antibactérienne des souches testées si, dans un premier temps,
nous observons et augmentons la présence de diamètres de zone
d'inhibition relativement proches ou supérieurs à ceux de notre antibiotique
de référence.
Dans une deuxième étape, la confirmation sera faite par le test de
micro dilution en milieu liquide.
CHRONOGRAMME
Novembre Décembre Janvier Février Mars Avril 2020 Mai 2020 Juin 2020
2019 2019 2020 2020 2020
Choix sujet + Réd
protocole
Validation du
protocole
Soutenance du
protocole
Obtention des
autorisations
Travail au
laboratoire
Rédaction de la
thèse
Soutenance de la
thèse
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BUDGET PRÉVISIONNEL
Total (FCFA)
Frais de récolte 50 000
Analyse physico-chimique 80 000
Location du laboratoire 100 000
Réactifs de laboratoire 200 000
Connexion Internet et communication 100 000
Frais de déplacement 20 000
Matériel didactique 20 000
Analyse statistique 100 000
Imprévus 100 000
Total 770 000

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MERCI POUR VOTRE ATTENTION

33

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