Universidad Autónoma de Yucatán

Campus de Ciencias de la Salud

Facultad de Química
Dra. Fabiola Villa
Toxicología

ADA 3. Seminario: Caso Clínico

EQUIPO VERDE
- Cortés Flores María Teresa
- Díaz Russell Julio Ismael
- Escamilla Tamayo Sandra Edith
- Mutul Pech Daniel Aldair 10/10/2019
- Pavía López Mauricio Humberto
- Poot Cocom Kassandra Marily
 CASO CLÍNICO
Acude a Servicio de Urgencias a 48 A ingreso: temperatura de
Masculino de 58 años. horas de haber iniciado 37°C, angustia, diaforesis,
Ocupación: Chofer. Adecuados padecimiento actual. Sensación coloración de tegumento y
hábitos de higiene-dietéticos. súbita de calambre y dolor tipo mucosas orales secas,
Sin antecedentes patológicos, urente en muslo derecho. Lesiones taquicardia, sin
solo tabaquismo por 30 años maculopapulosas muy dolorosas y alteraciones en
suspendido en la actualidad. violáceas. diafragma.

Figura 1 Ilustración del calambre. Figura 2 Ilustración taquicardia.

Figura Artículo con el caso clínico.

Figura 3 Ilustración de diaforesis. Figura 4 Ilustración de fiebre. 1

FUENTE DE EXPOSICIÓN
Presencia de placa
Poderoso VENENO con violácea, contenido
esfingomielinasa D hemorrágico y
causante de hemólisis, serohemático. Piel
afecta vaina de mielina, marmórea. Úlceras con
agregación plaquetaria y bordes necróticos y
necrosis cutánea. centro pálido de 10 x 10
cm. Dolor a la
Loxosceles laeta palpitación.

Hialuronidasa → Extensión de la lesión

Proteína sérica amiloide → Necrosis y
lesión tisular
Lipasa → Causante de cicatrices
deprimidas en tejido celular subcutáneo

Figura 5 Lesión característica de la Figura 6 Ilustración de diaforesis.

mordedura de Loxosceles laetaa. 2
SIGNOS Y SÍNTOMAS
Lesiones cutáneas Alteraciones hematológicas y renales

Mácula violácea equimótica, Anemia hemolítica

rodeada por un área pálida Hemoglobinuria
isquémica
Oliguria
Ampollas de contenido líquido o
hemorrágico. Anuria
Costra o escara necrótica Insuficiencia renal aguda
Úlcera Rabdomiolisis

Otras manifestaciones

Náuseas, vómito, cefalea, fiebre, dificultad respiratoria, mialgias,

distensión abdominal

3 *Signos sistémicos en las primeras 24-48

 DIAGNÓSTICO
- La araña o su picadura pasan inadvertidas, la aparición de síntomas no es
inmediata
- Eminentemente clínico.

Estudios de laboratorio ELISA

● Biometría hemática completa. Detectar veneno circulante y

● Química sanguínea en la lesión
● Pruebas de funcionamiento esfingomielinasa-D
hepático
● Examen general de orina
● Pruebas de coagulación

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Figura 7 Picadura de loxosceles reclusa

Picaduras de otros insectos y arácnidos que producen lesiones cutáneas

4
 Emergencia: Hielo local
TRATAMIENTO Herida limpia y descubierta, inmovilizar la
parte afectada del cuerpo, evitar
propagación del veneno.

● Inhibe la migración de los neutrófilos al sitio

de la lesión
● Disminuye la producción de radicales libres
de oxígeno
● Estabiliza la membrana lisosomal →
Disminuye el dolor, proceso inflamatorio y
Figura. 8 Dapsona de 50 mg
necrosis

Antiinflamatorios no
esteroideos

Antibacterianos

Antihistamínicos
5
 Universidad Autónoma de Yucatán
Campus de Ciencias de la Salud
Facultad de Química
Dra. Fabiola Villa
Toxicología

ADA 3. Seminario:
Técnicas moleculares
EQUIPO VERDE
- Cortés Flores María Teresa
- Díaz Russell Julio Ismael
- Escamilla Tamayo Sandra Edith
- Mutul Pech Daniel Aldair
10/10/2019
- Pavía López Mauricio Humberto
- Poot Cocom Kassandra Marily
TÉCNICAS MOLECULARES
Técnicas de laboratorio que usan ADN, ARN o proteínas, para su el
aislamiento, extracción en alta pureza, visualización para conocer su
estado, para cortarlos y pegarlos, para la amplificación de una región en
una enorme cantidad de moléculas

Entre las técnicas más útiles en este proceso se

encuentran:

Electroforesis Técnicas de Técnicas de Southern, ELISA

en gel hibridación Northern y Western blot

PCR convencional, cuantitativa

Biochips Inmunohistoquímica
o transcriptasa inversa

Tecnología Clonación de Citometrí Secuenciación

microarray genes a de flujo de ADN
11
 CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo (CMF) constituye una técnica avanzada, automatizada, objetiva
y altamente sensible, que permite evaluar diferentes características
simultáneamente de una célula o partícula en suspensión, como son el tamaño y la
complejidad interna, así como, algún componente celular o la función marcada con
fluorescencia (alteraciones estructurales y funcionales).

En la Toxicología ...
Evaluación de la viabilidad
celular
La determinación de la viabilidad
celular es el conteo de las células
vivas (sanas) o muertas en una
muestra.

Las células muertas que presentan daños en su membrana

plasmática o una disfunción mitocondrial como consecuencia de la
acción citotóxica de un xenobiótico.

12
 CITOMETRÍA DE FLUJO
FUNDAMENTO
Una de las formas de evaluar la integridad de la membrana, es el uso de colorantes
de exclusión o colorantes de retención.

Los de inclusión utilizan sustratos

Los colorantes de exclusión tiñen los
fluorescentes que son degradados por
ácidos nucleicos de las células con
las enzimas intracelulares y que
membranas deterioradas.
generan productos fluorescentes

Las células vivas con membranas intactas → habilidad para excluir colorantes que
fácilmente penetran la membrana plasmática de células muertas o dañadas.

MÉTODO
La tinción de células no viables con
yoduro de propidio.

Figura Estructura química Yoduro de propidio. 13

INTRODUCCIÓN
La CMF se ha aplicado al estudio del efecto tóxico de las sustancias sobre la
espermatogénesis de varias especies (Ratón, rata y hámster dorado).

Se evaluó la posibilidad de OBJETIVO

utilizar CMF para analizar células
● Demostrar el uso de material testicular
testiculares de ratón
en parafina como alternativa del
material en fresco, para determinar el
nivel de ploidía en las células
● El cadmio es tóxico para la
germinales a través de CMF.
reproducción, causando un
alteración en la barrera
hematotesticular.
● Efectos toxicológicos: Disminución del número y motilidad de
espermatozoides y aumento de anomalías.
● Validación: Comparación de resultados con material fresco.

Protocolo validado: “Evaluación del efecto tóxico del Cd y el PbCl2 en la

espermatogénesis de los ratones, a nivel de cada etapa celular específica.
MATERIALES Y MÉTODOS Diferentes protocolos
para muestras en
fresco y muestras
parafinadas*
Animales

● Ratones machos de 7 semanas. Se les otorgó agua y comida.

→ Temperatura constante (22+/- 2 °C), humedad relativa (40-60%)
Desparafinado y
rehidratación:
Xileno y alcohol
Muestras en parafina

● Se analizaron dos protocolos para el aislamiento de núcleos. En ambos se

utilizaron dos o más secciones (40 μm de grosor) como muestra correspondiente a
cinco ratones diferentes.

Protocolo P2
Muestras

Incubación a 80°C + Digestión a 37°C

HNO3 por 2 h a 6.0 pH con pH 1.5 Lavado
con ácido cítrico
 MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras frescas
Protocolo F1
Muestras

Los testículos se Filtración con Centrifugación

diseccionarón en una malla de durante 5 Resuspensión
tampón TNE nylon de 55 μm minutos

Protocolo F2
Muestras

Los testículos se Filtración y Incubación y

diseccionarón en fijación en centrifugación Resuspensión
pepsina - HCl etanol

Protocolo F3

Los testículos se Centrifugación,

Muestras

Filtración y Resuspensión y resuspensión,

diseccionarón en
centrifugación fijación (días) incubación y se añadió
ácido cítrico y
Tween Na2HPO4
ANÁLISIS DE CITOMETRÍA DE FLUJO
En todos los protocolos, las muestras se trataron con 50 μg/mL-1 de RNAse para
eliminar el ARN y se tiñeron con 50 μgmL-1 de yoduro de propidio (PI).
Las muestras fueron analizadas dentro de un período de 15
minutos.

INSTRUMENTO
Citómetro de flujo Coulter EPICS XL Los resultados se obtuvieron
(Coulter Electronics, Hialeah, FL, EE. UU.). en forma de tres gráficos:
➔ Intensidad de luz de
Equipado con un láser de iones de argón fluorescencia lineal (FL),
refrigerado por aire sintonizado a 15 ➔ Dispersión de luz de
mW y funcionando a 488 nm. ángulo directo (FS) vs
dispersión de luz de
La fluorescencia emitida desde los ángulo lateral (SS)
núcleos se recogieron a través de un ➔ Pulso FL integral versus
filtro dicroico de paso largo 645 y uno altura de pulso FL.
de paso de banda 620.
RESULTADOS

Protocolo
F2
Figura 1 . Los citogramas de
la columna izquierda
muestran la dispersión de la

Protocolo
luz del ángulo frontal (FS)

F3
frente a la dispersión de la
luz del ángulo lateral (SS), los
histogramas de la columna
central muestran la
intensidad de la luz de
fluorescencia relativa (FL) del Protocolo
yoduro de propidio y los P1
citogramas de la columna
derecha muestran la integral
del pulso FL relativo vs.
altura relativa del pulso FL.
Protocolo
P2
RESULTADOS

Fig.5 . Porcentaje de células

Figura 2. Variación porcentual
de ploidía de células
germinales aisladas por el
Protocolo F2, Protocolo F3
(tejido fresco), Protocolo P1 y
Protocolo P2 (tejido embebido
en parafina).
Figura 3. Porcentaje de células
germinales aisladas de los
germinales aisladas de los testículos
testículos de control y
de control y expuestas a 1, 2 y 3 mg
expuestas a 74 y 100 mg PbCl2
de CdCl2/kg. El símbolo '*' indica una
/ kg. El símbolo '*' indica una
diferencia significativa entre el
diferencia significativa entre el
control y las muestras tratadas con
control y 74 y 100 mg de
1, 2 y 3 mg de CdCl 2 a p ≤ 0.05.
muestras tratadas con PbCl 2 a
p ≤ 0.05.
DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
El Protocolo P2 fue más reproducible en términos del número de núcleos
ejecutados por minuto, probablemente debido a la menor cantidad de
pasos involucrados. Por lo tanto, se seleccionó para evaluar el efecto del
cadmio y plomo en los testículos de ratón.

El cloruro de cadmio indujo un Dañó gravemente los testículos. Estos efectos a

aumento en el peso absoluto
y relativo de los testículos
24h después de la
administración.
El cloruro de plomo no indujo
cambios notables en la
histología de los testículos
corto plazo fueron observados por FCM, en términos
de alteraciones significativas en los porcentajes de
células germinales.
No se observaron cambios significativos en las
relaciones testículo/peso corporal o epidídimo/peso
corporal. Resultado dado por ausencia de
alteraciones en porcentajes de células germinales
testiculares. *

* Excepción de un aumento en el porcentaje de células en fase S. Este aumento puede estar

relacionado con la actividad mitogénica del plomo en linfocitos y células hepáticas. Estos
resultados sugieren que la barrera hematoencefálica protege el epitelio seminífero de los efectos
tóxicos del plomo.
 Figura 6.-Efectos histológicos de 1, 2 y 3 mg de CdCl en
testículos de ratones. (A) Control, (B) 1 mg CdCl / kg, (C) 2 mg
CdCl / kg y (D) 3 mg CdCl / kg.
REFERENCIAS
1.- Pérez, E.; Rodríguez, R.; Sánchez M.C. Loxoscelismo cutáneo-visceral. Archivos
de Medicina de Urgencia de México. 2009, 33-38.
2.- Swanson, D.; Vetter, R.; Bites of brown recluse spiders and suspected necrotic
arachnidism. N English J Med 2005, 352.
3.- López-Durán M, Campo-Trapero J, Cano-Sánchez J, Díez-Pérez R, Bascones-
Martínez A. Aplicación de las técnicas de biología molecular en oncología oral.
Av. Odontoestomatol. 2010; 26 (4): 189-196.
4.- Barberena E.; Ríos E. Manual de Prácticas de laboratorio. Citometría de flujo.
UAMUI. 2014. Pp. 65-9.
5.- Oliveira, H., et al. Flow cytometry evaluation of lead and cadmium effects on
mouse spermatogenesis; Reproductive Toxicology 22 (2006) 529–535