UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y BIOTECNLOGÍA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA
INGENIERÍA DE LAS ENZIMAS

TEMA: Aplicaciones Biomédicas de enzimas

inmovilizadas: una actualización

Integrantes: Aguirre Ana, Guamán Damaris, Ortiz

Alejandro y Solís Juan
Curso: Octavo
Fecha: 02/01/2020
 INTRODUCCIÓN

Detectar sustancias bioactivas

Las enzimas pueden promover reacciones químicas de forma

altamente selectiva y una conducta estereoselectiva.

Altamente activas en un entorno fisiológico suave.

En medicina uso limitado:

Naturaleza lábil de estas moléculas, la posibilidad de
reacción inmunogénica y su dificultad para acumularse
en el sitio objetivo.
 Enfoques de modificaciones enzimáticas

Encapsulación o la reticulación

Enzima inmovilizada

Parte no catalítica Parte catalítica o parte

(portador o soporte) funcional (enzima)

Proporcionan una entidad estable y funcional

 Las enzimas Las enzimas
modificadas inmovilizadas

Biosensor para
Tratamiento de
el diagnóstico
ciertas
de un
enfermedades
enfermedad

• Defectos congénitos del

Detección Medición Registro metabolismo.
• Enfermedades
cardiovasculares
• Cáncer
Niveles de un • Tratamiento de la
biomarcador intoxicación, etc.
 Inmovilización enzimática
La unión de la enzima, ya sea
covalentemente o por adsorción
Inmovilización basada en el apoyo
a un soporte (inmovilización por
unión)
Mediante la unión de una enzima
y un soporte de manera iónica o
Entrecruzamiento covalente

La unión debe ser lo

suficientemente fuerte como
La mezcla de enzimas CLE (enzima reticulada) para no liberar la enzima,
y un agente de
CLEC (cristales de enzima pero lo suficientemente suave
1960 entrecruzamiento se reticulados) como para asegurar la
forman agregados
CLEA (agregado de preservación de la actividad
activos de reticulante. enzima reticulada)
enzimática.
 -Polímeros sintéticos
El atrapamiento -Polímeros biodegradables (polímeros y copolímeros
puede lograrse derivados del ácido láctico y glicólico, alginato,
quitosano, etc.)
reteniendo: -Mediante el uso de otros materiales biocompatibles

Vesículas formadas por una bicapa de

Liposomas fosfolípidos en el rango nanométrico

formulaciones de liposomas

AmBisome® o DOXIL®

quimioterapia anticanceroso
 Los fármacos hidrofílicos se encapsulan en el
espacio acuoso interno, mientras que los fármacos
lipofílicos quedan atrapados en la membrana de
fosfolípidos.

prolongan el
tiempo de
circulación in vivo
encierran
fármacos hidrófilos
en sus espacios
acuosos internos
mejorar la
orientación a acoplamiento de ligandos
sitios específicos
A medida que la enzima se encapsula dentro
de la vesícula, sus determinantes de antígeno
quedan enmascarados del sistema inmunitario
 Nano/micropartículas
poliméricas

-Polímeros biodegradables para

obtener partículas superiores a 10 nm

Ventajas La enzima inmovilizada puede dispersarse (a),

-Capacidad de liberación controlada disolverse (b) o adsorberse (c) en los polímeros que
-Versatilidad de formulación forman la partícula
-Tamaño subcelular y
biocompatibilidad
 ÁREAS TERAPÉUTICAS
Trastornos raros; enfermedad que afecta a
seis pacientes por cada 10.000 habitantes,
Terapia de reemplazo enzimático
en conjunto suman entre 5,000 y 8,000
trastornos

una enzima faltante o disfuncional es la

responsable
Deficiencia de prolidasa:
por ulceración crónica
Aparece como un trastorno de la piel, retraso mental
consecuencia de autosómico e infecciones
distingue
un defecto en el recesivo raro respiratorias.
gen de la
prolidasa (PEPD,
19cen-q13.11)
 Prolidase (E.C. 3.4.13.9) hidroliza los dipéptidos que contienen residuos
de prolina o hidroxiprolina en un extremo C
terminal

alteración de la remodelación de la matriz y al crecimiento celular

postula que puede ser necesaria para la curación,

inflamación, angiogénesis, proliferación y síntesis de
proteínas

Enzimas con propiedades antioxidantes

(ROS) implica daño a las células y los tejidos,

producida debido al estrés oxidativo

Neutralizado por
superóxido
ROS podría ser neutralizado
dismutasa (SOD)
 MATERIALES
Materiales para la Preparación de
Prolidase
Inmovilización de prolidasa el
quitosano en nanopartículas
Materiales para la caracterización
de nanoesferas Cargado-prolidasa
prolidasa de riñón porcino, polvo
liofilizado, ≥100 U / mg de proteína
glutamato de quitosano, Protosan
G213, MW 150,000 600,000 g
Tripolifosfato de hexahidrato de la
sal pentasódico, TPP
Tris (hidroximetil) aminometano,
TRIS
ácido clorhídrico, HCl
MnCl2
Glycine-proline
glutatión forma reducida
tricloroacético acid
tetraborato de sodio
Ciclodextrina
 prolidasa de riñón porcino, polvo
liofilizado, ≥100 U / mg de proteína
Bovine serum albumin, fraction V
Huevo L, tipo α-fosfatidilcolina XI-E,
Materiales para la EPC
preparación de liposomas Cholesterol
prolidasa-Loaded Diestearoilfosfatidilcolina-
polietileno glicol 2000, DSPE-
PEG 2000
Cloroformo-d que contiene 0,03%
de tetrametilsilano
MnCl2
Tris (hidroximetil) aminometano,
TRIS
glutatión reducido forma, GSH

Materiales para la caracterización
de liposomas prolidasa-Loaded
Triton X-100
microensayo ácido bicinconínico,
proteína BCA kit reactivo de
ensayo
glutatión reducido forma, GSH
Tris (hidroximetil) aminometan, TRIS
Gly-Pro peptide
Trichloroacetic acid, TCA
Dihidrógeno fosfato de potasio,
KH2PO4
hexanosulfonato de sodio

Materiales para la Preparación de Super óxido
Dismutase- Cargado nanopartículas
Materiales para la caracterización de la SOD
Loaded nanoesferas
Materiales para la preparación de liposomas de
SOD-Cargado
Materiales para la caracterización de los
liposomas de SOD-Cargado
Super óxido dismutasa, SOD, liofilizadas eritrocitos
bovinos en forma de polvo
Poly (re,lLáctico-co-glicólico) ácido, láctido:
glicólido proporción de 50:50, PLGA
ácido tartárico de dimetilo, DMT
Rat Serum Albumin, RSA
alcohol polivinílico, PVA
Cloroformo
BCA Protein Assay Kit
kit de ensayo de SOD
Super óxido dismutasa, SOD, liofilizadas eritrocitos
bovinos en forma de polvo
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina,
DOPE
El ácido fosfatídico, PA
Cloroformo
10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-
piperazineethane- ácido sulfónico), pH 7,4
kit de ensayo de SOD
BCA Protein Assay Kit
 MÉTODOS
El cargado de Prolidasa en nanoesferas pueden prepararse por gelación ionotrópica seguido
por una etapa de tratamiento con ultrasonidos.

Preparación de Cargado-prolidasa
1. Añadir 250! L de 200 UI / ml de prolidasa a 1 mg / ml de quitosano glutamato solución.

2. Añadir 1 ml de solución TPP a una velocidad constante de 0,5 ml / min a 2,5 ml de 1 mg /

ml de solución de quitosano glutamato contención ing la enzima bajo agitación magnética
de 300 rpm. Emulsionar la mezcla por tratamiento con ultrasonidos durante 4 min a modo
discontinuo a 20 kHz.

3. Separar las nanopartículas con ultracentrifugación a 12.000 × g durante 15 min a 4 ° C

(repetir el procedimiento tres veces para lavar las nanopartículas).

4. Resuspender las nanopartículas en 500 l de agua destilada.

Determinación de eficiencia de encapsulación
La eficiencia de encapsulación (EE) indica el porcentaje de la enzima encapsulada con respecto
a la cantidad total utilizada para la preparación de las nanopartículas.
1. Tomar los sobrenadantes recuperados en la etapa de centrifugación.
2. Determinar la cantidad de enzima en los sobrenadantes claros por espectrofotometría UV
(Beckmann DU7500) a 280 nm.
3. Calcular la cantidad de proteína encapsulada restando la cantidad no encapsulado de
proteína a la proporción proteína añadida.
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒ì𝑛𝑎 𝑎ñ𝑎𝑑𝑖𝑑𝑎
𝐸𝐸 = × 100
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒ì𝑛𝑎
 Determinación de la actividad prolidasa
1. La actividad biológica de la enzima se determinó por el método de electroforesis Illary cap-
descrito por Viglio. La actividad enzimática de corresponde prolidasa una unidad a la hidrólisis de
1 mol de Gly-Pro por minuto a 37 ° C. Pesar una cantidad adecuada de prolidasa cargado nanopar-
quitosano tículos y dispersar en 2 ml de 50 mM Tris-HCl, pH 7,8.
2. Tomar 1 ml de la suspensión de nanopartículas e incubar que noche a la mañana a 37 ° C en una
activación tampón consistente en 50 mM Tris-HCl, mM MnCl2 1, glutatión 0,75 mM forma
reducida, recién preparado a pH 7,8.
3. Comienzo de la reaccion añadiendo 0.4 mM glicil-lprolina para a 1 h a 37 ° C.
4. Detener la reacción con ácido tricloroacético al 70 l de 2,7 M.
5. Centrifuge a 6.000 rpm durante 5 min.
6. Inyectar las muestras bajo presión (10s, 0,07 MPa) sobre un no recubierto de sílice fundida capilar
de 50 cm de longitud efectiva × 50 micras operativo ID a 25 ° C y la aplicación de tensión de 25 kV
por un sistema de Beckmann P / ACE 2100.
7. Utilice tetraborato de sodio 50 mM, pH 9,3 que contiene 30 mM una ciclodextrina como
electrolito de fondo para separar.
8. Determinar los analitos a 214 nm.
9. Calcular la mol de Gly-Pro hidrolizado a 37 ° C por minuto (IU)
 Preparación de liposomas cargados con
prolidasa
1. Preparar una solución lipídica clorofórmico mezclando a 1: 1 molar de colesterol ratio y
EPC.
2. Añadir 10% en moles de DSPE-PEG.
3. Seco la mezcla de lípidos en un evaporador rotatorio durante 1 hora a 40 ° C con el fin
de reducir a una película delgada
4. Formado sufre película una corriente de N2 a 0,01 atm durante 1 h para asegurar la
evaporación del disolvente orgánico.
5. Realizar hidratación de película durante 1 hora a 27 ° C con una solución acuosa de
solución de prolidasa (0,266 a 1,064 mg / ml) en BSA al 0,5% (en prolidasa BSA 1: 5 w / w
ratio) en MnCl2 1,2 mM, 0,1 mM en 50 mM Tris-HCl (solución TMG).
6. Centrifugar a 16.400 rpm como una etapa de lavado en una centrífuga Eppendorf
5417R.
7. Suspender el sedimento en solución TMG.
8. Extruir la formulación se resuspendieron a través de 100 de membrana de tamaño de
poro nm usando LiposoFast-100 dispositivo extrusor.
9. Filtro estéril de los liposomas con un filtro de 0,22! M.
 Determinación de la eficiencia de encapsulación en liposomas
Definir cantidad total de proteína en liposomas por medio de ácido bicinconínico (BBCA)
microensayo, en comparación con la curva estándar entre 20 y 2.000 g / ml.
1. Preparar reactivo mezclando 1 parte de reactivo B a 50 partes de reactivo A.
2. Place 25 ul de muestras y curva estándar en la microplaca, teniendo en cuenta que un
rango de trabajo en es 20-2,000 g / ml.
3. Añadir 200uL de reactivo a cada pocillo y mezclar bien.
4. Deje que se incuba durante 30 min a 37 ° C.
5. Se enfrió la placa a temperatura ambiente y se leyó a 562 nm de longitud de onda.
6. Restar valor en blanco a la curva estándar y de muestras.
7. Terreno curva estándar de blanco corrige el valor estándar versus concentración mg / ml.
8. Utilice la curva estándar para determinar la cantidad de proteína en las muestras.
9. Tomar en cuenta que, aparte de la enzima nanopartículas con- tiene BSA. cantidad de
proteína Calcular en la formulación siguiente al de esta ecuación
 ACTIVIDAD DE PROLIDASE POR
HPLC
Preparar soluciones:
a) 1.2 mM MnCl2
b) Gly – Pro péptido 30mM
c) 0.45 M Ácido
Tricloroacético
- Calcular la cantidad
remanente Gly – Pro.
- Reducción del péptido
es linealmente a t
incubación.
- Referencia curva de
calibración Gly – Pro.
- Centrifugar a 21900g (5
- Incubar enzima con min.)
100 - Sobrenadante inyectar
uL s/n A (45 min – 37 en el sistema HPLC
°C). (C18 fase de columna, 5
- Añadir 100 uL s/n B um poro, 250 x 4.6 mm)
- Detener la reacción Fase móvil 10mM KH2PO4
con s/n C Tasa de flujo: 1.9 ml/min
210 nm
La Actividad
Enzimática
demuestra:
1UI de prolidase
corresponde a la
hidrólisis de 1 umol
Gly – Pro x min. A 37
°C.
 Inmovilización con cargado
SOD
- Pesar 81 mg PLGA y 9 mg - Emulsificar por
- Dejar en agitación
DMT. sonicación x 2 min. a
magnética por la
- Disolverlos en 3 ml de 55W.
noche a TA.
Cloroformo. - Verter la 1ra emulsión
- Agitar 1h al vacío
- Pesar lo necesario de en PVA 2% y luego se
(remover el solvente
SOD y 18 mg RSA para UI debe hacer el paso
orgánico).
5000. anterior.

Resuspender las
- Separar nanopartículas nanopartículas en 10 ml de
con ultracentrifugación
agua destilada y liofilizar
30000 rpm (20 min. 4°C).
- Realizar 3 lavados.
durante 48 h.
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA ENCAPSULADA EN
PLGA
- Recoger el - Restar el valor del
sobrenadante de los blanco a muestras y
lavados y determinar - Agregar 200 uL en curva estándar.
proteína con KIT BCA. cada pocillo mezclar - Trazar la curva valor
- Mezclar el reactivo A – B bien. estándar corregido en
- Colocar 25 uL de - Incubar a 37 °C x 30 blanco versus
muestra y curva min. concentración μg /mL.
estándar en la - Enfriar a TA y leer a 562
microplaca (20 – 2000 nm.
ug/ml).

- Tener en cuenta que,

aparte de la enzima, las
nanopartículas
contienen RSA.
 Inmovilización de SOD con
Liposomas
- Prepare la solución lipídica
clorofórmica a una - Incube a TA – 15 min.
concentración de 550 nmol. - Sonique la mezcla en un
- Dejar evaporar el sonicador de tipo baño
cloroformo. durante 1 minuto.
- Agregar 250 μL HEPES 10
mM.
.
DETERMINACIÓN DE LA ENCAPSULACIÓN
- Solubilizar liposomas en
Tritón X-100.
- Coloque 25 μL de muestras
y curva estándar en la
microplaca.
- Agregue 200 μL de reactivo
SOD
- Dejar incubar durante 30
minutos a 37 ° C. - Use la curva estándar
- Enfriar a TA y leer a 562 para determinar la
nm. cantidad de proteína en
- Reste el valor en blanco muestras.
a la curva estándar y a
las muestras.
 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD SOD
- Mezclar liposomas con
Tritón X-100
- Coloque 20 μL de la
muestra en pocillos.
- La muestra debe agregarse
en el espacio en blanco 2 y
destilarse dos veces agua
en los espacios en blanco 1
y 3.
- Agregue 200 μL de solución de
trabajo WST a todos los
pocillos y mezcle.
- Agregue el tampón de dilución
a los espacios en blanco 2 y 3.
- Incubar a 37 ° C
durante 20 min y
leer la absorbancia
450 nm.
- Agregue 20 μL de
solución de trabajo
enzimático a los
pocillos de muestra
y en blanco 1.
 NOTAS

La energía de sonicación
utilizada en este paso es lo RSA se utiliza para
Se agrega DMT para facilitar la
suficientemente suave como estabilizar la enzima de
liberación de enzimas de NP la interfaz activación.
para preservar la actividad
enzimática.