CINETICA ENZIMATICA

BIOQUIMICA APLICADA
CINETICA ENZIMATICA

Estudia la velocidad de las reacciones

catalizadas enzimáticamente

Los principios generales de las

reacciones químicas se aplican
también a las reacciones enzimáticas
Toda reacción implica varias etapas, involucrando la formación
y desaparición de especies químicas transientes o
intermediarios de la reacción.

E+S ES EP E+P

Complejo Complejo Producto

Sustrato enzima- enzima-
Enzima
sustrato producto
Factores que afectan la velocidad de
una reacción enzimática

1. Concentración de Enzima
2. Concentración de sustrato
3. pH
4. Temperatura
 Factores que afectan la velocidad de
una reacción enzimática
1. Concentración de Enzima: la velocidad varia directamente proporcional
Con la [E] a cualquier [S] constante
2. Concentración de sustrato: La velocidad varía en forma hiperbólica
Con la [S] a cualquier [E] constante
3. Efecto del pH del medio
El sitio activo de la enzima esta frecuentemente compuesto de grupos ionizables
que deben estar en la forma iónica adecuada para mantener la conformación,
unir los sustratos o catalizar la reacción.
La actividad de la enzima debe ser medida al pH óptimo
 4. Temperatura

A medida que aumenta la temperatura por lo

general aumenta la actividad catalitica dentro del
margen de estabilidad de la enzima
En el efecto de la temperatura hay dos componentes:
1. Aceleración de la reacción según la ecuación
de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

4. Efecto de la Temperatura
Representación de dobles recíprocos
Michaelis y Menten describieron un modelo cinético que describe una
curva parabólica de velocidad de reacción, en relación a la
concentración de sustrato.

En este tipo de curva de reacción, la enzima presenta un primer componente que

es proporcional a la concentración de sustrato (parte lineal de la curva V/[S]) y un
segundo componente que tiende hacia su Vmax, donde la velocidad se hace
independiente de la [S] (ploteo de la curva)
No todas las enzimas cumplen con esta cinética michaeliana. Existen
otras cuya velocidad de reacción describe una curva sigmoidea que
indica que:
La unión de una molécula de sustrato en un sitio activo influye en la
unión de otra molécula de sustrato en un segundo sitio activo y así
sucesivamente.
Para enzimas con unión de moduladores:
Una enzima con cinética sigmoidea puede pasar a cinética michaeliana en
presencia de activadores o acentuar su comportamiento original en
presencia de inhibidores.
 Ecuación de Michaelis-Menten

Cuando la [S] es  Km la velocidad de la reacción es proporcional a la [S]:

Vmax
V0 = K x [S] Parte lineal de la curva
m

Cuando la [S] es >>> Km la velocidad de la reacción se acerca a la Vmax:

V0 = Vmax Ploteo de la curva

 Km de algunas enzimas

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónicoa HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
 KM
La KM es un parámetro de Actividad Enzimática

La KM es inversamente proporcional con la

actividad de la enzima.

Valor de KM grande, baja actividad

Valor de KM pequeño, alta actividad

Significado de la constante Km
• La KM es un parámetro de Actividad Enzimática
• La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima.
• Valor de KM grande, baja actividad
• Valor de KM pequeño, alta actividad

• Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

(en condiciones de equilibrio rápido)

• Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato

(en condiciones de equilibrio rápido)

• Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

• Concentración de substrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (s0.5)

• Se define para una pareja enzima-substrato

• Se mide en unidades de concentración

¿Por qué determinar Km?

Km es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato

cuando k3<k2. Km=(k 2+k3)/k1

Km establece un valor aprox. para el valor intracelular de sustrato

Km es constante para una enzima dada, permite comparar enzimas

de diferentes organismos o tejidos o entre distintas proteínas

Un cambio en el valor de Km es un modo de regular la enzima

Kcat/ Km es una medida de la eficiencia catalítica

K3 = k cat Vmax = Kcat Et

Kcat=Vmax/Et Número de recambio

COMPORTAMIENTO CINÉTICO MICHAELIANO

Ecuación de Michaelis-Menten
 Representación directa

v
100
Vmax
80

60
V s
v  m x
40 K m  s

20

s
0
0 20 40 60 80 100

Km
ECUACIÓN DE LINEWEAVER-BURK
Gráfico de dobles recíprocos
GRÁFICO DE DOBLES RECÍPROCOS 1/V VERSUS 1/[S]
 Representación recíproca doble
(Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
0.02

1 Km 1 1
-1/Km   
0.01 v V mx s V mx

0.00
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s
 Michaelis - Menten
Vmx
Vmx S
Vi =
½ Vmx KM   S

1/[S]
KM

1/Vi

-1/KM
1/Vmx

1/[S]
Ecuación de Lineweaver-Burk
-1/KM
 Diagrama de Eadie-Hofstee

Vmax
v
v  K m  V m x
s
-KM
 Diagrama de Eadie-Hofstee
De manera similar a otras técnicas que permiten linearizar la ecuación de
Michaelis-Menten, el digrama Eadie-Hofstee permite visualizar
rápidamente los parámetros cinéticos importantes como Km y vmax a la vez
que está menos afectada por el margen de error que el diagrama de
Lineweaver-Burke, debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos
para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de
reacción.

Una de las consecuencias de la aproximación de Eadie-Hofstee es que

tanto la variable en la ordenada como en la abscisa no son
independientes, sino que dependen de la velocidad de la reacción. De
éste modo, cualquier error experimental se encuentra presente en ambos
ejes.
 Modelo Hanes- Woolf

s 1 K m
 s 
ax
Vm v Vmx V mx
1/

Km/Vmax

-Km
Vi
Modelo Eadie - Hofstee

Vi
Vi   Km.  Vmx
[S]
Y   m.X  a

Vi/[S] b
A  Vmx
B   Km

Modelo Hanes Woolf

[S] [S]/Vi VS[S]

V
[S] KM 1
  .[S]
Vi Vmx Vmx
Y  a  bx
KM
A
[S] Vmx
1
B
Vmx
 Parámetros enzimáticos
1. Km (constante de Michaelis-Menten para cada enzima) =
concentración de S a la que la V es 1/2 Vmax. Es una medida de la
afinidad del enzima por el S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad
del enzima por el S.
2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de
moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de
enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato.
3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros
activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)
4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de
sustrato por min = una forma común de expresar la velocidad
5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la
preparación enzimática. Unidad más moderna: kat = nmoles de
producto / seg
 Unidad de Actividad Enzimática (U):
La cantidad que transforma 1.0 mol (10-6 M) de S /min, a 25 0C, en
las condiciones de medida óptima.

Actividad específica:
Es el no. de U de una E / mg de proteína.
Es decir: una medida de la pureza de la E.
Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable

Número de recambio
No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo, por una
molécula de E ( o por un solo sitio catalítico
Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000

B-Amilasa 1 000 000
B-Galactosidasa 12 000
Fosfoglucomutasa 1 240
Cuando:

Vo= Vmax Todos los sitios activos están

ocupados y no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax

KM representa la cantidad de sustrato necesaria

para fijarse a la mitad de la E disponible y producir
la mitad de la Vmax

KM representa la concentración del sustrato en

una célula
 INHIBIDORES
IRREVERSIBLES. REVERSIBLES.
Se unen covalentemente a Se unen a la enzima por el
residuos A.a. de la enzima mismo tipo de interacciones
impidiendo su acción. Efecto que se producen entre las
del mercurio, plomo, gases enzimas y los sustratos. Hay
neurotóxicos y compuestos INHIBIDORES COMPETITIVOS
arsenicales. Y NO COMPETITIVOS.
 Irreversibles
La enzima está perdida
prácticamente muere

Inhibición – 2 grupos

Reversibles
La enzima puede recuperar su
actividad

Competitiva
Reversibles No competitiva
Acompetitiva
 Inhibidor Irreversible

• Inhibición permanente
• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
• Modificaciones químicas de los grupos catalíticos.
• Modificada la enzima, está siempre inhibida.

Para distinguirlo de las enzimas reversibles se

someten a diálisis y si no se separan enzima e
inhibidor, éste es permanente.
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Acetilcolina

Acetilcolinesterasa

Acetato + Colina
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)

Acetilcolinesterasa

Tripsina

Elastasa

Fosfoglucomutasa

Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda

Malatión
 Inhibidor Reversible
• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la
actividad.

Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva  (Alostérica)
Antibióticos
Insecticidas Dolor

Hervicidas Inflamación
Inhibición enzimática
Venenos Infecciones
virales
Diferentes Medicamentos
Cáncer
 INHIBIDORES COMPETITIVOS
• Compiten con el sustrato por ocupar el sitio activo de la
enzima.
• Tiene una estructura similar a la del sustrato por lo que tiene
posibilidad de formar el complejo ES. Pero este complejo no
da productos y disminuye el número de moléculas de Enzima
libre para interaccionar con el Sustrato.
• Esta unión es reversible y aumentando la concentración de
sustrato aumentamos el número de moléculas de enzima
libre.
• Sulfas (inhibe pasos metabólicos en bacterias) y fluoruracilo
tratamiento de cáncer, actúan así.
• No se revierte aumentando la concentración de
sustrato. COMPETITIVOS
• La unión se hace en un sitio distinto al sitio activo y
por eso puede formarse el complejo EIS que no da
producto.
• La presencia del inhibidor actúa como si disminuyese
la concentración de la Enzima presente y por eso
nunca se llega a la velocidad máxima por más que
se aumente la concentración de sustrato.
• La Km de la reacción no varía.
 Inhibidor competitivo (IC)

IC se une a la enzima libre

•Compite con el sustrato por la unión a la
enzima
•Aumenta la Km sin afectar a Vmax
•Se puede revertir la inhibición añadiendo
más sustrato
 Inhibidor No-competitivo (NI)

NI puede unirse a la enzima libre o al

complejo ES
•Baja la Vmax, pero la Km no se altera
•NI no se unen al sitio catalítico donde se une
el sustrato
Inhibición Competitiva
 Inhibidores Competitivos
Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico

Sulfas Infecciones microbianas

Antihipertensores: Captopril y Enalopril

Alopurinol Controla la gota

Fluoruracilo Cáncer
 Inhibiciones de la actividad enzimática

El inhibidor se une al sitio activo de la enzima, compitiendo con el sustrato e

impidiendo su unión. Si se aumenta la concentración de sustrato, el inhibidor puede
ser desplazado del sitio activo. Por lo tanto, se afecta la Km de la enzima y la Vmax se
mantiene.
 Inhibición competitiva en un gráfico de dobles recíprocos

Km aumenta

Vmax se mantiene
 Inhibidor incompetitivo

El inhibidor incompetitivo se une al complejo

ES
•Baja la Km & Vmax, pero el cociente
Km/Vmax no se
altera
•Ocurre en reacciones multisustratos
Inhibición acompetitiva
 Acompetitiva. S ocupa un lugar distinto al I sólo I ingresa a E
cuando a ingresado S

Vi KM Vmx
S
2º
I E 1º

Con I
1/Si
Sin I

1/vmx

1/[S]
-1/KM
 Inhibidor mixto

Inhibidor mixto puede unirse a la enzima libre

o al complejo ES
•Aumenta la Km y disminuye la Vmax
Inhibición No Competitiva
El inhibidor se une a un sitio diferente al sitio activo afectando
la catálisis. La Km se mantiene y la Vmax disminuye.
 Inhibición no competitiva en un gráfico de dobles recíprocos

Km se mantiene

Vmax disminuye
 REGULACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Los seres vivos han generado mecanismos para regular las rutas
bioquímicas.

La AE en las células se ajustan a las necesidades fisiológicas,

cambiantes permanentemente.

A [S] bajas, la AE es proporcional a los niveles de S.

En condiciones fisiológicas, la [S] se encuentra por debajo o

próxima al Km, así los niveles de S, determinarán la mayor o menor
AE.

A mayor [S]  mayor AE

La E que cataliza la primera etapa de una vía metabólica suele ser
reguladora.
• La regulación es esencial por las siguientes razones:
 Mantenimiento de un estado ordenado  no hay desperdicio
de recursos.
 Conservación de la energía  utilización de la En suficiente en las
células, para consumir los nutrientes según sus necesidades
energéticas.
 Respuesta a variaciones ambientales son los ajustes rápidos
que deben realizar las células (pH, [S], T°C), por su capacidad de
aumentar o disminuir la velocidad de las reacciones específicas.
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Las enzimas llevan a cabo una serie de reacciones secuenciales que

constituyen las rutas metabólicas

A B C Y Z

Dichas rutas están perfectamente coordinadas entre sí y cada una

está regulada de forma muy precisa.

La velocidad de cada ruta está controlada para que refleje las

necesidades generales de la célula.

La primera enzima de la ruta suele ser limitante de la velocidad

(“enzima regulador”)
Enzimas Constitutivas Compartimentalización
 REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INDUCCIÓN Y REPRESIÓN DE LA SÍNTESIS
ENZIMÁTICA  A NIVEL GÉNICO
(modificación enzimática en horas o días)

INDUCCIÓN  síntesis enzimática aumentada

REPRESIÓN  síntesis enzimática disminuida

CONSECUENCIA  cambios en la población total de

sitios activos.

Una enzima puede responder a más de un tipo de regulación

 MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA

1. Control a nivel de sustrato

2. Inhibición reversible por productos

(retroalimentación)

3. Activación/inhibición alostérica (nivel celular)

4. Modificación covalente (supracelular):

• Reversible: fosforilación, metilación, acetilación,
ADP-ribosilación, etc.
• Irreversible: activación proteolítica
 1.- CONTROL A NIVEL DE SUSTRATO

Mediante interacción de los sustratos y productos de

cada reacción con la enzima

hexoquinasa
Glucosa + ATP -------> Glucosa-6-fosfato + ADP
_
El propio producto de la reacción puede
inhibir competitivamente a la enzima
 2.- CONTROL POR RETROALIMENTACIÓN
(Negativa)
Un aumento de concentración del producto final de una ruta
metabólica inhibe una de las primeras reacciones de la ruta
(generalmente la primera)

A ---> B ---> C ---> D ---> E

_
E actúa como inhibidor del primer enzima.
Ello impide:
• La utilización innecesaria del primer sustrato
• La acumulación del producto final
• Se evita la acumulación de intermedios
(al ser la mayoría R. Reversibles)
RUTAS METABÓLICAS CONTROLADAS POR RETROALIMENTACIÓN

RUTA ENZIMA INHIBIDOR

Glicolisis Fosfofructokinasa ATP

Neoglucogénesis FBP fosfatasa AMP

Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA

Bios. Colesterol HMGCoA reductasa Colesterol

Bios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

 3.- ENZIMAS ALOSTÉRICAS
- Son proteínas con múltiples subunidades (múltiples centros activos y
catalíticos)

- Presentan una cinética sigmoidal, indicativa de efectos cooperativos en la

unión del sustrato.

- Su actividad está regulada por otras moléculas efectoras.

- Pueden mantener las concentraciones de sus sustratos en valores

bastante constantes:
* Existe una concentración crítica de sustrato ([S]c) por debajo de
la cuál la enzima es prácticamente inactiva
* Un pequeño aumento de la concentración de sustrato, por
encima de la ([S]c, da lugar a un notable aumento de la actividad
enzimática
 ENZIMAS ALOSTÉRICAS

ENZIMAS HOMOTRÓPICAS:
El sitio de unión es a la vez el
sitio activo y el sitio regulador.
El sustrato puede funcionar
Enzima
Enzima como modulador.
muy
ineficaz eficiente

ENZIMAS HETEROTRÓPICAS:
El modulador es un metabolito
diferente del sustrato. El sitio
regulador es distinto del sitio
regulador.
http://www.upo.es/depa/webdex/biocel/Tecnicas/documentos/ENZYMAS-definitivo-.ppt#477,54,Diapositiva 54
http://www.upo.es/depa/webdex/biocel/Tecnicas/documentos/ENZYMAS-definitivo-.ppt#478,55,Diapositiva 55
 4.-MODIFICACIONES COVALENTES
Existen enzimas que están inactivas hasta que se activan por unión covalente con otras
moléculas y viceversa.
ADP-ribosilación
- metilación, acetilación
Algunas modificaciones son reversibles y otras no.

A. FOSFORILACIÓN/DESFOSFORILACIÓN
(serina, treonina, tirosina e histidina)

CH2OH CH2OH CH2OH

O O O
H H H H H H
H H H
HO OH H O OH H O OH H O ....

H OH H OH H OH EJEMPLO: Glucógeno fosforilasa

Pi Libera glucosa a partir de glucógeno

CH2OH
CH2OH CH2OH
O
H H O O
H O H H H H
-
H H
HO OH H O P O OH H O OH H O ....
O- OH
H OH
H OH H OH
 MODIFICACIÓN COVALENTE

Adición o remoción de grupos

fosfato sobre residuos de
Serina, Treonina o Tirosina ATP ADP

específicos de la enzima. QUINASA

DE
PROTEÍNAS

Quinasas de proteínas familia

de enzimas que catalizan
reacciones de fosforilación utilizan ENZIMA ENZIMA
como dador del grupo fosfato al OH OPO3=
ATP.

Fosfatasas de proteínas
separan los grupos fosfatos de las FOSFATASA DE
PROTEÍNAS
enzimas fosforiladas
HPO4= H2O
Otros grupos:
adenilo, uridilo,
metilo
Suele haber fenómenos de modificación covalente de
enzimas en la respuesta celular a diferentes señales:
1. Neurotransmisores
2. Hormonas
3. Factores de crecimiento
4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación
5. Muerte celular programada (apoptosis)
6. Estímulos antigénicos
7. Luz y otros agentes físico-químicos
 ACTIVACIÓN POR RUPTURA PROTEOLÍTICA

EJEMPLO: Proteasas pancreáticas (tripsina,

quimotripsina, carboxipeptidasa)

Se sintetizan en el páncreas de forma inactiva

denominada zimógeno (mayores que la enzima
activa) para evitar que digieran el tejido
pancreático.

En el intestino se activan por ruptura protelítica y

finalmente son degradadas
ENZIMAS: APLICACIONES EN
LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

• Son muy antiguas sus aplicaciones

• Se usaron enzimas de un modo inconsciente hasta
finales del siglo XIX en que se descubrieron los
artífices de las reacciones
• Es un gran activo económico, y la investigación va
encaminada a la purificación y la obtención de
enzimas concretos para funciones concretas
 FABRICACIÓN DEL QUESO

• La operación mas importante es la coagulación de la

caseína
• Para ello utilizamos una serie de enzimas que
podemos encontrar en vegetales o animales
• La pepsina y la quimosina son las enzimas mas
importantes en esto
• Se encuentran en el cuajo de varios animales, entre
ellos los rumiantes
 FABRICACIÓN DEL QUESO

• Otras enzimas como papaina o rennina

• Estos producen coágulos elásticos
• La utilización de unas u otras enzimas
repercute activamente en el sabor y en la
naturaleza del queso
 INDUSTRIAS LÁCTEAS

• La lactasa es el enzima que

consigue romper la lactosa,
que es el azúcar que
contiene la leche
• Mucha gente es intolerante
a la lactosa
• Existen en el mercado
leches que vienen con
lactasa
 INDUSTRIA PANADERA
• La mas comúnmente utilizada es la lipoxidasa,
que conjuntamente con el blanqueante, le da
a la masa un carácter mas manejable
• Esta contenida en la harina de soja y de otras
leguminosas
 INDUSTRIA PANADERA
• Para aumentar la acción de la levadura se
añade amilasa, en forma de harina de malta
• Se usan para ello también algunos mohos que
contienen la enzima
• La harina de malta, tiene un inconveniente, y
es que cambia el color del pan
 INDUSTRIA CERVECERA
• El proceso fundamental es la rotura del almidón
• Los azucares simples formados son fermentados por
las levaduras
• Esto se lleva a cabo con las amilasas, provenientes de
la malta
• A veces se añaden otros almidones como de arroz o
patata para aprovechar al máximo la actividad de las
enzimas
 FABRICACIÓN DE ZUMO
• Las pectinas provocan que los zumos sean
demasiado viscosos y turbios.
• Esto se elimina con enzimas, amilasas,
contenidos en el propio zumo o que se
pueden añadir
• En el proceso, como subproducto tenemos
metanol, que aparece en muy baja
concentración
 MÁS APLICACIONES ALIMENTARIAS

• En productos derivados del huevo, se añade

glucosa-oxidasa y catalasa para evitar que se
oscurezcan
• Bromelina y papaína se usan para ablandar la
carne, ya que rompen proteínas
• La lactoperóxidasa ayuda a conservar
productos lácteos
OTRAS APLICACIONES NO
ALIMENTARIAS
 DETERGENTES
• Estos llevan enzimas que ayudan a limpiar
• Las proteasas facilitan la eliminación de
manchas de origen proteico
• Las lipasas eliminan las manchas de grasa y
otros compuestos orgánicos
• Estos detergentes que llevan enzimas se
denominan detergentes biológicos
 TRATAMIENTO DE RESIDUOS I

• El principal objetivo es reducir materiales

poliméricos que puedan suponer un peligro
medioambiental o un estorbo en
determinados procesos industriales
• Existen enzimas que hidrolizan materiales
poliméricos para su posterior degradación
microbiológica
 MEDICINA Y FARMACIA

• El uso de enzimas en el sector médico y

farmacéutico es potencialmente inmensa
• A pesar de ello, su utilización es mínima
• Se usan en puntos en los que se tiene una
seguridad absoluta de su aprovechamiento y
de su eficacia