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1985 Kerry Mullis met au point la technique de PCR (Prix nobel en 1993)
1988 Saïki et al. utilisent la Taq polymérase
C’est une technique qui a été mise au point en 1985 par Mullis K.
PCR
“ Polymerase Chain Reaction ”
des n
ion s atio
i
t
xa rce éris
n
tio F o lym
ur
a am Po
t
na
Dé
Séquence-cible
Composants de la réaction
ADN
5’ 3’
Amorce Sens
dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP )
Amorce Reverse
3’ 5’
ADN polymérase
Cycles de la réaction
Etape de dénaturation
Température : 94 à 95°C
Durée : 1 min maximum
Etape d’hybridation
Température : 3 à 5°C en dessous du Tm ( 40 à 70°C )
Durée : 30 sec à 1 min
Etape d’élongation
Température : 72°C
Durée : 30 sec à + min ( fonction de la taille )
Cycles de la réaction
e
ial
t
ini
ion
n
tio
tio
at
ra
ra
ur
n
tu
tu
n
at
tio
tio
na
na
n
Température
ga
ga
Dé
Dé
Dé
ion
n
n
n
tio
Elo
Elo
t
ida
94°C 94-95°C 94-95°C
ida
br
br
72°C 72°C
Hy
Hy
40-70°C 40-70°C
Temps
Cycles de la réaction
Cycle 1
Cycles de la réaction
Elongation
Dénaturation-Hybridation
Cycle 2
Elongation Elongation
...
...
Cycles de la réaction
...
Séquence cible
Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4 n cycles
2n copies
1 = 20 2 = 21 4 = 22 8 = 23 16 = 24 copies
Cycles de la réaction
Cela voudrait dire que si la quantité d’ADN de départ était de 100 ng, on
obtiendrait une quantité de 3.4 kg
Cela
n’arrive
jamais !
Effet “ plateau ”
Matrice ADN
Amorce Sens
Amorce Reverse
Tampon de réaction
dNTPs
ADN polymérase
H2O
Une PCR multiplex est une PCR simultanée de 2 ou + séquences cibles (en
utilisant +ieurs couples d’amorces) dans une même réaction d’amplification
Dénaturation-Hybridation
E l o n g a t i o n
n cycles
Paramètres critiques de la PCR
Matrice d’ADN
mARN AAAAAAA
TTTT
mARN AAAAAAA
cADN TTTT
- Production de mutations
- Création de sites de restriction (PCR-RSI)
- Détection d’homologues de gènes
- Amorces dégénérées
...
Paramètres critiques de la PCR
~ 200 nM ~ 60 nM
Ex: En réalisant des PCRs multiplex avec plusieurs couples d’amorces équimolaires, les
concentrations d’amorces utilisées diffèrent selon la PCR
Paramètres critiques de la PCR
Amplifications parasites
Un autre moyen consiste à réaliser 2 PCRs successives en utilisant des couples
d’amorces différents, le 2ème couple encadrant une séquence incluse dans celle
qui est amplifiée par le 1er couple d’amorces
ADN cible
Dénaturation-Hybridation
1er couple d’amorces Elongation
rces tion
le d’ Hybrida
Elongation n cycles
amo
-
2 ème turation
coup
a
Dén
Paramètres critiques de la PCR
Désoxyribonucléotides
Enzyme d’amplification
La première enzyme utilisée en PCR était le fragment Klenow de l’ADN
polymérase I
La Taq polymerase est une enzyme qui ne possède pas l’activité 3’-5’
“proof reading” correctrice d’épreuves
Pour la plupart des applications, ces erreurs ne sont pas gênantes, si les
paramètres analysés sont la taille ou la présence du produit amplifié
On peut aussi utiliser des enzymes fidèles (ex: Vent polymerase, Pfu
DNA polymerase)
Paramètres critiques de la PCR
Les tampons d’amplification contiennent aussi des sels, dont les plus
importants sont le KCl et le MgCl2
KCl
[KCl] forte (> 2.4x) Amplification des fragments de petite taille favorisée
[KCl] faible (< 1.2x) Amplification des fragments de grande taille favorisée
Les meilleures conditions sont obtenues à une concentration d’~ 2x ( 50 mM )
Paramètres critiques de la PCR
MgCl2
C’est un co-facteur des ADNs polymérases qui affecte l’activité de l’enzyme, mais aussi
l’hybridation des amorces et la fusion de l’ADN (Tm)
Adjuvants de la PCR
Glycérol ( 5% )
DMSO ( 10% )
Volume de la réaction
Programme d’amplification
Dénaturation
Programme d’amplification
C+, C: Mélanges multiplex, Y (flèche bleue): Paires d’amorces, Flèches à gauche: Produits PCR
attendus, Flèches jaunes: Produits PCR attendus, Flèche magenta: Produit aspécifique
Programme d’amplification
Temps d’élongation de 1 mn : Les fragments de petite taille sont favorisés alors que
ceux de grande taille sont défavorisés
Temps d’élongation de 4 mn : Inversement
Paramètres critiques de la PCR
Programme d’amplification
Nombre de cycles
Contaminations
Compte tenu du principe même de la PCR, qui consiste à amplifier de l’ADN
à partir d’infimes sources de matrice, les contaminations d’ADN étranger
sont un problème majeur parfois difficiles à maîtriser
Pipetage
Etant donné les faibles volumes (micro-volumes) prélevés lors de la préparation des
PCRs, des erreurs de pipetage surviennent fréquemment
Pour contourner ce problème, il faut préparer des pré-mélanges contenant tous les
constituants de la PCR (sauf l’ADN) et les répartir ensuite dans chacun des tubes à
amplifier
Règle 1
Règle 2