Вы находитесь на странице: 1из 67

Плахотний Игорь Николаевич

нач. отдела экспериментальных исследований,


экологической безопасности земель и качества продукции

+380964772507 ,
e-mail: igor_pin@mail.ru
URL: www.garryc2008.narod.ru
Количественная тонкослойная
хроматография
В настоящее время к тонкослойной хроматографии (ТСХ)
возобновился интерес, нарастающий по мере разработки новых
неподвижных фаз и оборудования для нанесения проб, новых
методов элюирования пластинок и количественного определения
анализируемых веществ непосредственно на пластинках. За
последние десятилетия активно совершенствуются средства для
количественного анализа результатов ТСХ. При достаточно
развитых методах подготовки и нанесения проб, проявки
веществ, при использовании современных сорбционных
материалов, именно конечный этап анализа - оценка
результатов тормозит использование метода для проведения
точного количественного анализа. В настоящий момент в
основном используется субъективный метод оценки - визуальное
сравнение с градуировочными пятнами или геометрическое
измерение размеров пятна. Что влечет за собой недоверие к
ТСХ, как количественному методу.
Количественный анализ в тонкослойной
хроматографии имеет несколько видов,
характеризующих каждый этап развития метода.
И хотя некоторые методы можно применять
только как полуколичественные, они до сих пор
используются на практике.
Метод визуального сравнения.

Интенсивность окраски пятна и его размер зависит от количества


хроматографируемого вещества. Поэтому визуальное
количественное определение построено на нескольких приемах.
Метод разбавления. Этот метод заключается в том, что для
каждого вещества определяют предельную концентрацию, при
которой вещество не может быть определено
хроматографическим методом. При хроматографировании
исследуемого вещества поводят разбавление до тех пор, пока
оно перестает проявляться на пластинке. 
Содержание вещества С, определенное таким методом находят
по формуле:
С=a·n
где n -разбавление, а -концентрация вещества, при котором оно
не проявляется при хроматографировании.
Метод определения площади
пятна.
Если наносить одинаковые объемы исследуемых
веществ и свидетелей, то получившиеся после
хроматографирования площади пятен пропорциональны
логарифму концентрации вещества :

S= a·Ln(c) + b
где а и b - эмпирические коэффициенты, определяемые
экспериментальным путем.
   
Если пятно разделенного вещества имеет резкие
границы, то площадь пятна можно определить
планиметром. Этот метод дает ошибку до 10-15%.

  Необходимость более достоверного результата


количественного определения привела к использованию
инструментальных методов.
Метод элюирования.

Этот метод заключается в том, что разделенное вещество


смывают с сорбента растворителем и определяют его
концентрацию уже другими методами - фотометрическими,
полярографическими и т.д. Это достаточно точный метод, но
только при условии количественного выделения разделенного
вещества. Из-за высокой трудоемкости метод используется
достаточно редко и неприемлем при большом количестве
исследуемых образцов.
Фотоденситометрический метод
Человеческий глаз может обнаружить на ТСХ-пластинке в
лучшем случае около 1 —10 мкг окрашенных компонентов с
воспроизводимостью не лучше чем 10—30%. Удаление с
пластинки разделенных пятен, содержащих анализируемые
вещества, элюирование их с сорбента и определение при
помощи фотометрии раствора требуют много времени и не
обеспечивают достаточной правильности.
Свой вклад в проблему вносят также трудность точного
определения края пятна при визуальном наблюдении,
неполное элюирование пробы с сорбента и неспецифическое
фоновое поглощение из-за присутствия коллоидных частиц
сорбента в анализируемом растворе.
Поэтому фотоденситометрический метод является самым
перспективным направлением развития количественного
метода в ТСХ. Этот метод анализа состоит из двух этапов:
сканирование рабочей поверхности пластинки для ТСХ -
получение цифровой копии изображения и компьютерный
расчет конечного результата.
Фотоденситометрический метод
(ФД)
Этот метод может быть использован без выделения
вещества с пластинки и основан на определении не только
площади пятна, но и его интенсивности. Это наиболее точный
метод определения концентрации веществ, так как позволяет
при использовании калибровочных графиков, проводить
достаточно точные количественные определения всех
разделенных веществ (до 2-10%) непосредственно на
пластинке за короткий промежуток времени. Неудивительно,
что при развитии тонкослойной хроматографии, применение
денситометров увеличивается, чувствительность и,
следовательно, точность определения концентрации
разделенных веществ повышается и приближается к точности
высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Аппаратура (денситометры) для определения веществ
непосредственно на ТСХ-хроматограммах впервые появилась в
1967 г. и в настоящее время считается необходимой для
правильного определения размеров и положения пятна,
точного измерения разрешения и быстрого и правильного
количественного анализа.
Принцип работы
денситометров
Приборы для сканирующей денситометрии, имеющиеся в
продаже, в общем имеют много сходного. Для того чтобы
охватить весь диапазон УФ — видимого излучения в пределах
200—800 нм, эти приборы используют в качестве источников
света разные лампы. Видимое излучение получают с помощью
галогеновых или вольфрамовых ламп, а УФ-излучение —
дейтериевых. Для флуоресцентного анализа предпочтительно
использовать высокоинтенсивные ртутные или ксеноновые
дуговые лампы.
В современных сканирующих денситометрах применяются в
основном три оптические схемы .

Оптические схемы, используемые в различных сканирующих


денситометрах:
а —однолучевая;
б —одноволновая двухлучевая с разделением в пространстве;
в —двухволновая однолучевая с разделением во времени.
L — источник; МС — монохроматор; РМ — фотоумножитель;
СН — обтюратор; Р — пластинка.
 Самой простой является однолучевая схема (а) , позволяющая получать
превосходные количественные результаты, но при ее использовании могут
возникнуть затруднения из-за ложного фонового шума, обусловленного
флуктуациями выходного сигнала источника, неравномерности распределения
посторонних поглощенных примесей и неоднородности поверхности пластинки.
Фоновые помехи можно до некоторой степени скомпенсировать при
использовании двухлучевой схемы.
 В двухлучевой оптической схеме (б) с разделением в пространстве один луч
монохроматического света разделяется на два, которыми сканируют разные
участки пластинки. Одним лучом сканируют участок пластинки с пробой, в то
время как другой проходит по области пластинки, не содержащей пробы. Оба
луча последовательно детектируются при помощи спаренных фотоумножителей,
разностный сигнал подается на самописец, и таким образом компенсируются
флуктуации выходного сигнала источника. Хотя два луча падают на разные
области пластинки, тем не менее небольшие неоднородности на поверхности
пластинки и нежелательный фон, обусловленный примесями, содержащимися в
слое сорбента, все еще могут создавать затруднения.
 При использовании однолучевой двухволновой схемы (в) флуктуации,
вызванные рассеянием излучения с длиной волны поглощения (λ1),
компенсируются при помощи вычитания флуктуации, наблюдаемых для
излучения с другой длиной волны (λ2), которое не поглощается пятнами, но
претерпевает такое же рассеяние, как и излучение с λ1. Два луча модулируются
при помощи обтюратора и объединяются в один луч для подачи разностного
сигнала на детектор.
 Чувствительность сканирующего
денситометра сложным образом
зависит от качества электронных и
оптических компонентов прибора. По
мере увеличения ширины щели
величина сигнала снижается
незначительно, тогда как при
изменении высоты щели наблюдается
гораздо более заметное уменьшение
сигнала. Когда высота щели велика по
сравнению с диаметром пятна, поток
света, отражаемый от участков
пластинки, не содержащих
анализируемой пробы, велик по
сравнению с вкладом поглощения
света,обусловленного присутствием
пятна. Сигнал в этом случае будет
слабым.
Изменение величины сигнала в зависимости от
размеров щели для щелевого сканирующего
денситометра при измерении поглощения

 По мере того как высота щели


уменьшается до величины, близкой
к диаметру пятна, наблюдается
существенное увеличение сигнала.
Это связано с тем, что
концентрация пробы по диаметру
пятна не является постоянной,
сигнал продолжает увеличиваться
по мере того, как высота щели
уменьшается до величины,
меньшей диаметра пятна. Однако
при этом определяющим является
отношение сигнал/шум. Поэтому
оптимальными значениями высоты
щели является величина,
превышающая видимый диаметр
пятна примерно на 5 %.
Теоретическое рассмотрение
количественного анализа
 Все оптические методы количественной оценки тонкослойных
хроматограмм основаны на определении разницы между
оптическими откликами от участков пластинки, не
содержащих компоненты пробы, и от участков, на которых
присутствуют разделенные вещества. Распространение света
в непрозрачной среде представляет собой очень сложный
процесс, который математически можно описать только в том
случае, если ввести некоторые упрощающие допущения.
Наибольшее распространение получила теория Кубелки —
Мунка .
 В теории Кубелки — Мунка принимается, что пропущенные и
отраженные части падающего света состоят только из лучей,
распространяющихся в сорбенте в направлении,
перпендикулярном плоскости поверхности пластинки. При
распространении лучей по другим направлениям длина пути
гораздо больше, и они поэтому гораздо сильнее поглощаются.
Следовательно, вкладом таких лучей в общее количество
пропущенного или отраженного света можно пренебречь.
Особенности калибровки в
количественной ТСХ
 Ограничение, устанавливающее распространение
лучей только в прямом и обратном направлении, не
относится к свету, возбуждающему среду, и на границе
пластинка/воздух такой свет распределяется под всеми
возможными углами к поверхности. Предполагая, что
коэффициент рассеяния сорбента не изменяется в
присутствии пробы, можно вывести следующее
уравнение:
(1  R ) 2 2,303
  am  c
2  R S
R∞ — коэффициент отражения непрозрачного слоя
бесконечной толщины,
аm — молярный коэффициент поглощения пробы,
с — молярная концентрация пробы,
S — коэффициент рассеяния на единицу толщины.
Особенности калибровки в
количественной ТСХ
 Хотя уравнение и устанавливает зависимость
интенсивности отраженного света от концентрации пробы,
его нельзя рассматривать в качестве идеального для целей
хроматографии, так как при его использовании принимают,
что слой сорбента имеет бесконечную толщину. Кубелка и
Мунк получили более значимые решения, выраженные в
явном виде с помощью гиперболических функций для
интенсивностей, но для количественного анализа
тонкослойных хроматограмм и они все еще представляет
весьма трудную задачу.
 Измерения отражения и пропускания особенно
чувствительны к небольшим изменениям в методике
эксперимента и в материалах. На правильность и
воспроизводимость количественных определений будут
оказывать влияние изменения толщины слоя, качество слоя
(размер частиц и распределение частиц по размерам),
форма и размер пятна и единообразие элюирования пробы.
Особенности калибровки в
количественной ТСХ
 Поэтому для улучшения воспроизводимости стандарты
для калибровки должны хроматографироваться на
каждой пластинке, используемой для анализа.
Стандарты для калибровки необходимо готовить с
различными концентрациями и наносить на пластинку
в постоянном фиксированном объеме растворителя.

 Следовательно, для правильного количественного


определения пятна стандартов и проб должны быть
одного размера.

 Калибровочные кривые, построенные путем измерения


отражения и пропускания света пробой
непосредственно на пластинке, являются по своей
природе нелинейными. Это полностью соответствует
теории Кубелки — Мунка.
Вид калибровочных кривых согласно
Кубелки-Мунка

О 50 100 150 2ОО нг

Калибровочные кривые (зависимость площади пика от величины пробы) для


некоторых стероидов при измерении поглощения:
1— 17β-дигидроэквиленин; 2—17α-эквиленин; 3—17α-дигидроэквиленин;
4—17β-эстрадиол; 5 — 17β-эстрадиол; 6 — эквилин; 7—β-дигидроэквилин;
8 — эстриол; 9 — эстрон; 10— 17α-дигидроэквилин.
Практическая калибровка
 Обычно имеется узкий диапазон концентраций, в пределах
которого калибровочные кривые можно рассматривать как
линейные. Линейный динамический диапазон калибровочной
кривой зависит от свойств вещества и в благоприятных
случаях может быть пригоден для целей анализа.

 Чаще всего в условиях проявительной ТСХ при использовании


измерения интенсивности отраженного света линейный
диапазон находится в пределах 0,5 – 10 мкг вещества в зоне.
Для методик, в которых применяется измерение
флуоресценции линейные диапазоны на порядок больше.

 Если аналитику необходим более широкий диапазон


концентраций, то самым простым решением является
применение калибровочной зависимости второго порядка вида
y = ax2 + bx + c , где у –площадь хроматографического пика
(пятна), х- концентрация, a/b/c – коэффициенты полинома 2-й
степени.
Некоторые условия
количественной ТСХ
 Для правильного количественного определения,
пятна стандартов и проб должны быть одного
размера, а значит рекомендовано использование
самплеров, позволяющих дозировать пробу при
нанесении строго определенными порциями.
 Рекомендуется проводить предварительное
концентрирование проб на хроматографической
пластине, проводя предварительное
хроматографирование на высоту 10-20 мм в
системе самого полярного компонента рабочей
подвижной фазы.
 При проявлении пластин нужно использовать
систему проявления пластин погружением, либо
УЗИ опрыскиванием, но никак не опрыскиванием
из пульверизатора !
Пример использования различных
систем проявления ТСХ

Опрыскивание пульверизатором Проявление погружением


 В качестве примера реализации фотоденситометрического
метода можно привести комплекс "Scaner 3" фирмы CAMAG TLC
(Швейцария) с программным обеспечением "Cats".
Разрешающая возможность сканирующего устройства
составляет 25 мкм. Сканирование поверхности происходит в
монохроматическом освещении с шагом изменения длины
волны - 5 нм. Для оптического диапазона 350-900 нм это
составляет 110 градаций цветов, при 16 битном измерении
освещения общая степень градации признака цвет - освещение
составляет 7,2 млн. С помощью программного обеспечения
проводится расчет Rf, определение цвета пятна,
идентификация вещества по этим параметрам и вычисления
параметров пятна: площади, оптической плотности. По
градуировочным данным автоматически рассчитывается
количество определяемого вещества.
 Именно такая методика регистрации и вычисления результатов
позволяет превратить ТСХ в метод точного количественного
анализа. Основной недостаток - значительная стоимость
оборудования, которое значительно тормозит внедрение
фотоденситометрического метода в практику исследований для
многих лабораторий Украины. Например, стоимость
вышеприведенного комплекса составляет приблизительно
125 тыс. грн.
 Однако преимущество сейчас получает
несколько иное направление обработки ТСХ
пластин – это Видеоденситометрия. В
качестве метода детектирования в
тонкослойной хроматографии, кроме
использования специализированных
дорогостоящих сканеров, можно
использовать анализ изображения. При
анализе изображения в качестве детектора
используют видеокамеру или планшетный
сканер. Преимущества этого метода состоят
в том, что при его использовании отпадает
необходимость проведения механического
сканирования, можно проводить обработку
двумерных хроматограмм, количественный
анализ которых очень трудно осуществить
при помощи обычной сканирующей
денситометрии, и, кроме того, он позволяет
очень быстро получать информацию, так как
сигнал, поступающий от всех пятен,
накапливается одновременно.
 При использовании этого метода для веществ с сильным поглощением
пределы обнаружения обычно составляют не менее 0,1 мкг при
измерении поглощения. Разрешение ограничивается числом пикселов
(элементов картинки), которое позволяет получить используемое
устройство.
 На наш взгляд все преимущества ФД можно реализовать, используя
современную оргтехнику, которая за последнее десятилетие быстро
развивается за счет использования новейших технологий электронного
производства. Тем более, при стремительном совершенствовании
стоимость оборудования постоянно уменьшается. Для примера
рассмотрим обычный планшетный сканер . Его стоимость обычно
составляет 400 грн. Разрешающая способность - 600 dpi (42 мкм).
Такой точности для проведения ТСХ-анализа в большинстве случаях
более, чем достаточно. При линейных размерах пятна -10 мм,
погрешность сканирования изображения, составит, менее чем 0.5%. В
специальных ТСХ-анализах высокой точности можно использовать
профессиональные сканеры с разрешающей способностью 1200 dpi
(21 мкм), стоимость которых составит приблизительно 1.5 тыс.грн.
Интенсивность цветов передается 24-битным значением. Таким
образом, параметр цвет-освещение имеет 16 млн. градаций, что
достаточно для проведения спектрального анализа ТСХ.
 Этот принцип положен в основу оборудования для ТСХ нескольких
Российских и зарубежных компаний, например ОАО «ИМИД»
(Сорбфил Видеоденситометр), НПЦ «ЛенХром» (ДенСкан)
 Основной «изюминкой» программно – аппаратных комплексов для
количественной обработки ТСХ является программное обеспечение,
которое позволяет решать многие вопросы метода количественной
тонкослойной хроматографии.
 Поэтому для решения задач количественного анализа с помощью
метода ТСХ применительно к технологии отраженного света
окрашенных соединений, достаточным будет наличие планшетного
сканера, компьютера и специализированного программного
обеспечения.
ТСХ-Менеджер 4.01 2009
автор : Плахотний Игорь Николаевич
Назначение программы
 Не каждая аналитическая или исследовательская лаборатория у нас может
себе позволить дорогое оборудование.
 Аналитик, занимающийся ТСХ рано или поздно сталкивается с проблемой
хранения результатов такой хроматографии: пластинки выцветают, осыпается
слой, окраска устойчива в течении нескольких минут и.т.д. Учитывая все
сказанное выше, "ТСХ - менеджер" реализует методы сканирования
хроматограмм с использованием обычных планшетных сканеров или цифровых
фотокамер, которые гораздо доступнее и дешевле ТСХ-денситометра.
 Графические образы ТСХ - хроматограмм хранятся в базе данных. Их можно
обрабатывать, получая результаты в виде обычных хроматограмм, какие
привыкли видеть на самописцах или интеграторах газовых или жидкостных
хроматографов. Соответственно пятна на ТСХ хроматограммах теперь
выглядят как хроматографические пики, которые уже являются количественной
оценкой разделяемых веществ.
 Программа выполняет многие операции автоматически, имеет индивидуальные
настройки для каждого метода, производит градуировку по ДСТУ ISO 8466-1-
2001 и ДСТУ ISO 8466-2-2001 реализуя тем самым линейную и
полиномиальную градуировки.
 Для целей денситометрирования предлагается относительно недорогая компьютерная техника
– планшетный сканеры, цифровые фотокамеры.Программа "ТСХ - менеджер" ориентирована
на оценку хроматограмм этими компьютерными устройствами. Сканер , сканируя
хроматограмму , переводит ее в компьютерное изображение в виде графических файлов, в
которых сохраняется информация обо всех цветовых переходах на ее поверхности.
 Принцип обработки таких графических файлов программой "ТСХ - менеджер" близок к работе
двухлучевого денситометра. Оператор задает размер щели , фоновое положение и
осуществляет процесс перевода графического изображения в пределах щели в оцифрованный
хроматографический сигнал.
Как происходит оцифровка ?
 Оператор ограничивает зоны
денситометрии на ТСХ зонами
треков, т.е. указывает место
разделения компонентов одного
нанесенного на ТСХ образца.
 Программа в пределах этого
трекового пространства с
определенным шагом
дискретизирует изображение, т.е.
делит на фрагменты в которых
оценивает либо яркость пикселов,
либо суммарное значение функции
цвета RGB (red/green/blue).
 Таким образом создается
двумерный массив (матрица)(I/J) с
конкретными данными. Первичные
данные корректируются на среднее
значение фона.
Как происходит оцифровка ?
Как происходит оцифровка ?
 Последующие преобразования
данных сводятся к усреднению
двумерного массива данных по
направлению J и
преобразованию в одномерный
массив.
 Таким образом получают
оцифрованную ТСХ,
аналогичную представленной.
Оцифрованный трек при
определении фосфолипидов
Экскурс по программе
Экскурс по программе
Анализатор ТСХ
Результаты денситометрии
Денситограмма
Метод
Калибровка
Обработка согласно метода
Обычный отчет
Расчеты проведены программой "ТСХ - менеджер" 4.01 @PinSoft 2009
~~~~~~~©~~~~~~~
Дата отчета : 24.01.2009 Время отчета : 21:02:15

Анализ : Pigmentsin
Дата : 02.08.2005
Оператор :
Пластинка : 10 х 15 см 0,2 мм Сорбфил УФ254
Объем нанесенного образца : мкл
Подвижная фаза :
Детекция : УФ(Гашение флуоресценции)
Проявитель :
Условия проявления:
Результаты анализа :

Показатель Обнаруженные компоненты


-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Tрек № 1 - Проба 1 TOTAL = 15676

№ 1 2 3

Rf 0,12 0,72 0,82

S 6567 309 8800

Название

Содержание
По-трековый отчет
Расчеты проведены программой "ТСХ - менеджер" 4.01 @PinSoft 2009
~~~~~~~©~~~~~~~

Анализ : Neosurf
Дата : 16.05.2009
Оператор : Игорь
Пластинка : 10 х 15 см 0,2 мм Сорбфил УФ254
Объем нанесенного образца : 4 мкл Неосурф (1 мл препарата + 9 мл Хлф:метанол 1:1)
Подвижная фаза : хлороформ : метанол : вода (50:40:4)
Детекция : Визуальная
Проявитель : 10 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле
Условия проявления: Нагрев при 120 °С
Температура : 25 °С
Влажность : 70 %

Tрек № 1 - Неосурф ЕН 020408

№ 1 2 3 4 5 6 7

Rf 0,09 0,14 0,23 0,68 0,82 0,89 0,95

S 773,00 3834,50 21557,49 933,58 3130,13 1914,76 1892,19

Название

Содержание
Отчет о калибровке
Расчеты проведены программой "ТСХ - менеджер" 4.01 @PinSoft 2009
~~~~~~~©~~~~~~~

Градуировка из файла : D:\My Work\TLC_MANAGER_PLUS_4NEW\Calibr_File\Cholesterin.CLB


-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Стандарт : ДСТУ ISO 8466-1-2001
Тип градуировки : Линейная 1
Уравнение регрессии : Y = 3423.197000* X + 4488.832000
Ошибка аппроксимации :444.7050
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Данные для градуировки :

X Y1 Y2 Y3 Y ср

1 8173.67 8173.6700

2 10986.37 10986.3700

5 21692.03 21692.0300

Основные характеристики градуировки :


Характеристика (ISO8466-1(2)-2001) Результат

ОБЩИЕ ПАРАМЕТРЫ

Остаточное СКО (Sy) 444.705

СКО методики (Sxo) 0.1299093

Коэффициент вариации (Vxo,%) 4.871597


Источники ошибок и
неопределенности в денситометрии
 Основными источниками ошибок в сканирующей денситометрии являются
воспроизводимость нанесения пробы v воспроизводимость
хроматографических условий (с), воспроизводимость позиционирования
пятна в центре щели (p) и воспроизводимость результатов измерений (m).
 В соответствии с законом распределения ошибок общая ошибка (t)
описывается уравнением:
(t)2 =(v)2 + (c)2 + (p)2 +(m)2
 Ошибку, возникающую при измерении (m) , можно определить посредством
сканирования одного и того же трека на ТСХ-хроматограмме без изменения
каких-либо экспериментальных переменных между сканированиями. В
принципе она не должна превышать 0,2-0,7 %.
 Ошибку при позиционировании пятна в измерительной щели определяют как
описано выше, но проводя позиционирование пятна в щели вновь за каждым
сканированием.
 Общая ошибка в этом случае включает ошибку позиционирования и ошибку
измерения известную из предидущего эксперимента и вычисляется по
уравнению :
(p) = ((t)2 -(m)2) 0,5
Источники ошибок и
неопределенности в денситометрии
 Очевидно, следует свести к минимуму эту ошибку, которая может стать
весьма значительной.
 При позиционировании важное значение имеет установка ширины щели
несколько большей за размеры пятна. Это будет способствовать
уменьшению данной ошибки за счет некоторой потери чувствительности.
 Ошибку , обусловленную нанесением пробы (v) , можно найти
посредством сканирования первого пятна на хроматограмме с малым
значением Rf, при котором, как полагают не возникает ошибки за счет
хроматографических условий. В свою очередь ошибку за счет нанесения
пробы можно найти по разности :
(v) = ((t)2- (p)2 -(m)2)0,5
 После нахождения этих ошибок можно вычислить по разности ошибку,
вызванную непостоянством хроматографических условий :
(c) = ((t)2 - (v)2 - (p)2 - (m)2)0,5
 Ошибка, вызванная непостоянством хроматографических условий,
вполне может быть самой большой, и уменьшить ее можно только за счет
сведения к минимуму колебаний параметров процесса элюирования.
Источники ошибок и
неопределенности в денситометрии
 В современной сканирующей денситометрии с
использованием ВЭТСХ-пластинок величина
относительного стандартного отклонения за счет
всех ошибок может быть не выше 2%, что делает ее
очень надежным методом количественного анализа.
 При использовании современных устройств для
нанесения пробы и сканирующих денситометров
самая большая ошибка, по-видимому, связана с
невоспроизводимостью хроматографических
условий.
 Дальнейшее улучшение воспроизводимости ВЭТСХ-
анализа можно будет достигнуто только за счет
улучшения элюирующих камер и более тщательной
оптимизации и стандартизации процесса
элюирования.
Рекомендации ISO/IEC 17025:2005 по оцениванию
неопределенности измерений в испытательных и калибровочных
лабораториях
Стандарт ISO/IEC 17025:2005 определяет международное признание
результатов испытаний и калибровок лабораториями, получивших
аккредитацию от органов, которые заключили MRA1 с аналогичными органами
других стран. Он законодательно закрепил необходимость наличия процедур
оценивания неопределенности измерений, проводимых в аккредитованных
лабораториях
а) при выборе, разработке и оценивании пригодности методов и процедур,
которые используются в деятельности лаборатории (п. 5.4.1):
б) при использовании стандартизованных и нестандартнзованных и
разработанных лабораторией методов и процедур калибровки или испытания
(п. 5.4.6):
в) при оформлении свидетельств о калибровке и протоколов испытаний
(п.5.6.2.1.1. 5.10.4.1);
г) при создании программ и процедур калибровки своих собственных
исходных эталонов, образцовых вешеств и оборудования, для обеспечения
прос.теживаемости проводимых лабораторией калибровок и измерений до
Международной системы единиц (SI) (п. 5.6).

MRA - The Mutual Recognition Arrangement - соглашение о взаимном признании национальных


эталонов и сертификатов о калибровке и измерениях, выпускаемых национальными метрологическими
институтами, подготовленное Международным комитетом по мерам н весам (МКМВ)
Основные термины и положения по оцениванию неопределенности
измерений
Неопределенностью измерении называется параметр, связанный с
результатом измерений и характеризующий рассеяние значений, которые
могут быть обоснованно приписаны измеряемой величине.
Основные положения концепции неопределенности (Рекомендация INС-1.
1980 г.):
1. Все составляющие неопределенности в результате измерения можно
сгруппировать в две категории в соответствии со способом их
оценивания:
А - составляющие, оцениваемые путем применения статистических
методов (обработкой результатов многократных измерений);
В - составляющие, оцениваемые другим способом (по характеристикам,
взятым из предыдущих экспериментов, из паспорта на прибор, методик
выполнения измерений, из справочников и т.д.). К источникам этих
неопределенностей относятся: случайные погрешности однократных
измерений; поправки, вводимые в результат измерения, неисключенные
систематические погрешности, погрешности справочных данных и т.д.
2. Составляющие типа А оцениваются как стандартные
(среднеквадратические) отклонения средних арифметических
многократных наблюдений (неопределенности типа А - uA).
Эти составляющие характеризуются числами степеней свободы ν (для
прямых многократных измерений ν = n -1 , где n - количество
многократных наблюдений, выполненных при измерении). Если
между составляющими типа А наблюдается статистическая взаимосвязь
(корреляция), то необходимо указывать коэффициенты корреляции
r(xi,xj)=rij
3. Составляющие типа В также оцениваются как предполагаемые
стандартные (среднеквадратические) отклонения, получаемые из известных
границ, в которых могут находиться значения этих составляющих
(неопределенности типа В - uВ ). Между составляющими типа В может
существовать предполагаемая взаимосвязь, тогда следует указывать
коэффициенты предполагаемой корреляции.
4. Суммарная стандартная (среднеквадратическая) неопределенность uС
рассчитывается по правилу суммирования дисперсий :
uc  u A2  u B2

5. Интервальной оценкой неопределенности является расширенная


неопределенность U . которую получают путем умножения стандартной
суммарной неопределенности uС на так называемый коэффициент охвата k.
При указании расширенной неопределенности указывают уровень доверия
вероятность Р. Обычно эта вероятность принимается равной 0.95.
Составление бюджета неопределенности
Вычисленные вклады неопределенности удобно представлять в
виде бюджета неопределенности, который включает в себя список
всех входных величин Х1,...,Хm их оценок х1,...,хm вместе с
принадлежащими им стандартными неопределенностями измерения
u(хi) и законами их распределения, а также числами степеней
свободы. Кроме этого для каждой величины таблица должна
содержать вклад неопределенности.
Для занесенных в таблицу числовых значений должны
указываться единицы измерения для соответствующей величины. В
нижней строке бюджета неопределенности можно расположить
информацию о выходной величине (входная величина Y, ее оценка
у, неопределенность входной величины u(у), эффективное число
степеней свободы veff, коэффициент охвата k, расширенная
неопределенность U ).
Бюджет неопределенности представляет собой таблицу и является
удобной основой для составления программы для оценивания
неопределенности измерений в среде Excel.
Исходные данные для расчетов бюджета
неопределенности
Исходные данные Исходные
Исходные данные
Исходные X данные (X-Xaver)2
СКО калибровки Sy
данные Y (рассчет по калибро
Y
калибровке) вки X
2164.670 4.9741362 1852.745 3.937172131 5.34917
2145.670 4.9109725 2492.75 6.064805888 0.03430
2125.340 4.8433874 2810.67 7.1216997 0.75986
2102.650 4.7679568 3037.665 7.876322281 2.64492 24.0187
2152.010 4.9320492        
20.27217041
2114.170 4.8062539      
2130.170 4.8594443 среднее знач. Σ
2112.830 4.8017992 6.25 8.78825
2124.830 4.8416920
2152.000 4.9320160  
Количество
измерен
среднее знач. среднее знач. ий Модельное уравнение измерения
2132.434 4.8669707 10
Формулы для оценки неопределенности
коэффициентов градуировочной зависимости
Y=a*х+b (S  b) V0
X 
S (a ) 
Sy  
 
1
S(b)  S y  
x2 a  V al  m  10
  n n n
 (x i  x )2  (x i  x ) 2
i 1
i1
Пример бюджета неопределенности согласно
GUM
РАСЧЕТ НЕОПРЕДЕЛЕННОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ Д.В. ТМТД (GUM)
• Стандарт
ная
• Значение • Границы • Число • Закон • Вклад
• Входные неопредел
входной входной степеней распредел неопредел
величины енность
величины величины свободы ения енности
входной
величины
S, [у.е.] 2132.434 20.27217041 10.13608521 9 А, нормальный 0.134785679
b, [у.е] 668.42 52.04278255 26.02139128 3 А, нормальный -0.346022237
а, [1/мкг] 300.806 8.102111098 8.102111098 3 А, нормальный -0.524456172
V0,[мл] 10 0.1 0.057735027 10000 В, равномерный 0.112397875
m ,[г] 0.05 0.002 0.001154701 10000 В, равномерный -0.449651452
Val,[мкл] 5 0.2 0.115470054 10000 В, равномерный -0.449651452
Значение Суммарная Эффективное
Выходная выходной стандартная число Коэффициент
Расширенная неопределенность
величина величины, неопределенн степеней охвата
% ость свободы
С, [%] 19.46788295 0.911020847 22 2.073873058 1.88934159
Недостатки подхода GUM к
оценке неопределенности
• В основе общего подхода лежит т.н. закон распространения
неопределенности, базирующийся на разложении нелинейной модельной функции в ряд Тейлора
первого порядка. Применение такого подхода при существенно нелинейной зависимости дает
смещенную оценку результата измерений и недостоверную оценку суммарной стандартной
неопределенности.

u 4 ( y)
 eff  m

u
i 1
i
4
( y ) / i

• При нахождении расширенной неопределенности предполагается, что закон


распределения выходной величины в соответствии с центральной
предельной теоремой - нормальный и коэффициент охвата хорошо
аппроксимируется коэффициентом Стьюдента с числом степеней свободы,
определяемым формулой Велча-Саттерсвейта. Первое предположение
справедливо для случая линейного модельного уравнения, большого числа
входных величин и их симметричных законов распределения.

• Формула Велча-Саттерсвейта принципиально не предназначена для работы с


коррелированными входными величинами и ее применение в этом случае
может привести к существенной недостоверности оценивания расширенной
неопределенности.
JCGM
Joint Committee for Guides in Metrology
YYY
Final draft
September 2006

Evaluation of measurement data — Supplement 1 to the “Guide to the


expression of uncertainty in measurement” — Propagation of distributions
using a Monte Carlo method

´ Evaluation des donn´ees de mesure – Suppl´ement 1 du “Guide pour l’expression de


l’incertitude de mesure” — Propagation de distributions par une m´ethode de Monte
Carlo

JCGM 2006— All rights reserved


Реализация алгоритма Монте-
Карло
1. Генерирование т массивов случайных чисел xj , j = 1,2,,,, m заданного
объема n (n=105-106), подчиняющихся требуемым законам
распределения.
2. Получение массива оценки выходной величины у объема n.
3. Вычисление оценок параметров полученного распределения:
математического ожидания Ḿ(у), суммарной стандартной
неопределенности ûс(у), коэффициента охвата k и расширенной
неопределенности Ûp для заданного уровня доверия р.
4. Повторение L раз (L=50-100) шагов 1-3 с получением усредненных
значений оценок перечисленных в п. 3 параметров и вычислением
оценки их СКО для определения их достоверности.
Схема реализации алгоритма
Монте-Карло
Расчет расширенной неопределенности измерения
содержания Д.В. ТМТД методом Монте-Карло
Входные величины, Входные величины,
оцениваемые по типу А оцениваемые по типу В Выходная Упорядоченная
Расширенная
величина, выходная
неопределенность
% величина
S,[у.е.] b, [у.е] а, 1/мкг V0,[мл] m,[г] Val,[мкл]

12745.49 5007.76 1726.74 7.46 0.0111 3.96 75.87 41.96 1.809


11845.22 4907.31 1691.45 7.43 0.0088 3.80 90.14 52.53
11742.10 4821.16 1672.34 7.56 0.0113 4.07 67.68 53.58 Коэффициент охвата
11682.33 5007.67 1639.52 7.50 0.0104 3.99 72.79 53.66 1.81
Суммарная стандартная
11191.90 5173.07 1699.50 7.53 0.0103 3.81 67.62 53.67 неопределенность
11738.31 5158.48 1659.79 7.43 0.0104 4.11 68.83 53.83
11578.43 4929.28 1689.09 7.52 0.0109 3.91 69.04 53.98
11561.14 4951.33 1656.49 7.58 0.0112 3.89 68.82 54.30 0.998
НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ

РЕАКТИВИ
Метод тонкошарової хроматографії
РЕАКТИВЫ
Метод тонкослойной хроматографии
REAGENTS
Method of thin-layer chromatography

• 1 СФЕРА ЗАСТОСУВАННЯ Цей стандарт поширюється на випробування


пов'язані з аналізом якості хімічних реактивів, фармацевтичних
препаратів та субстанцій з яких ці препарати виготовлені, зразків для
судебно-медичних експертиз та екологічного контролю, показників якості
або безпеки продуктів рослинництва та харчової промисловості та інших
зразків і встановлює метод проведення випробувань, який ґрунтується
на тонкошаровій хроматографії (далі – ТШХ).
Валидация в ТСХ
 Валидация - процесс установления характеристик и ограничений метода и
идентификации влияний, которые могут изменять эти характеристики и в какой
степени. С другой стороны, валидация - это процесс подтверждения того, что
метод является пригодным для соответствующей цели, то есть, для
использования для решения специфической аналитической проблемы.
 В соответствии со стандартом ISO 17025 все методы испытания, используемые
в лабораториях, должны быть валидированые и утвержденные. Валидация
методов выполняется для того, чтобы достичь необходимых характеристик типа
точности, воспроизводимости и надежности результатов испытания.

ОБЩИЙ НАБОР ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВАЛИДАЦИИ

 Правильность/точность (процент возврата Rec)


 Прецизионность (воспроизводимость SR/ сходимость Sr)
 Специфичность/ селективность
 Чувствительность /(LOD, MDL)
 Линейность
 Диапазон измерения
 Робасность
 Неопределенность U
Важные характеристики валидации для различных
типов испытания
Тип испытания Идентификация Тест на примеси Содержание или
эффективность
Количественно Предел
действия
Требование

Точность - + - +
Прецизионность:
Сходимость - + - +
Воспроизводимость - - (1) - - (1)
Специфичность + + + + (2)
Предел обнаружения - + + -
Предел
количественного - + - -
определения
Линейность - + - +
Диапазон - + - +
-= обычно не измеряется
+ = обычно измеряется
(1) может быть необходим в некоторых случаях
(2) Может не требоваться в некоторых случаях
Оценка нового аналитического метода

Литература Выбор метода Новый подход

Метод - кандидат
(разработка)

Валидация метода

Калибровка и линейность
Сравнение с Адекватность формы
референтными методами

Межлабораторные Точность (смещение) Укрепленные образцы


исследования

В пределах одного дня Прецизионность В пределах одного дня

Чувствительность и День ото дня


предел обнаружения

Специфичность Изучение влияний

Образец с известной
концентрацией Возврат Эффективность
подготтовки
Контроль качества Укрепленные образцы

Валидированный метод

Использование метода
Примеры валидационных карт
ЗБІЖНІСТЬ
Результати
Компонент
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 Xav SD RSD

Трибенурон-
метил, мкг 4,05 4,04 3,81 3,97 4,06 3,85 4,09 3,88 4,1 - 3,99 0,06 1,58

Показник Значення Примітка

0,168 мкг при нанесенні ,


Збіжність (r=2.8*SD)
або - 3,3 %

Маса або об'єм ( V1) проби, г або мл 0,010 г

Кінцевий об'єм ( V2) екстракту, мл 7,5 мл

Фактор збагачення (F=V1/V2) 0,0013

Об'єм введеної аліквоти(V), мкл 4 мкл

Концентрація стандартного розчину


(Amt), мкг/мл 1000 мкг/мл

Сигнал (висота піку або показання


приладу) стандартного розчину 11828,66
ЛІНІЙНІСТЬ
Компонент : Рівні
трибенурон-метил
1 2 3 4 5 6

Кількість (Amt,
1 2 3 4 5 6
Концентрація), мкг
Норма вмісту , г/кг 750
Відсоток від норми 25% 50 % 75 % 100 % 125 % 150 %
Площа, одиниці 6728,92 8337,99 10041,33 11829,33 13433,51 15086,59

Чинник відгуку
(RF=Площа/Amt), 6728,92 4168,99 3347,11 2957,08 2686,70 2514,43
одиниці/(мкг)
Показник Значення Примітка

Кількість рівнів (n) 6

Залишкове стандартне відхилення для ДСТУ 8466-1:2001 Sy1


32,882
лінійної регресії
Залишкове стандартне відхилення для ДСТУ 8466-1:2001 Sy2
58,623
квадратичної регресії

Критерій Мandel-теста (PG), Табличний критерій


1,13
PG 
( n  2)  S y21  ( n  3)  S y22 34,11
S y22

Рішення (лінійна; нелінійна) Лінійна

Робочий діапазон , мкг 1-6 мкг В точці нанесення


Коефіцієнт регресіі – А1 1681,797 Для рівняння лінійної
Коефіцієнт регресіі – А0 5023,322 регресії
Примеры валидационных карт
ТОЧНІСТЬ
Компонент Результати
Трибенурон-метил
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 Xav SD RSD

Значення закріпленого
зразка, Xf , мкг 4,258 3,795 4,097 4,003 3,927 3,719 3,867 3,95 0,18 4,6

Значення не закріпленого
зразка, Xunf, мкг 1,977 2,076 2,140 2,119 1,963 2,116 1,835 2,03 0,11 5,4

Додана кількість, Xadd, мкг 2 2 2 2 2 2 2 2 - -

Різниця, =Xf–Xunf 2,281 1,719 1,957 1,884 1,964 1,603 2,032 1,92 0,22 11,5

Відсоток повернення,
114 86 98 94 98 80 102 96 11 11,5
%RP Показник Значення Примітка
Кількість спостережень (n) 7
Середнє значення для закріпленого зразка Xf av,
3,95
мкг
Середнє значення для не закріпленого зразка Xunf
2,03
av
, мкг

Значення для доданого Xadd 2


Середнє значення для різниці , мкг 1,92
Стандартне відхилення SD, мкг 0,22
Відносне стандартне відхилення RSD , % 11,5
Середне значення відсотка повернення , % 96
Благодарю за внимание !