Вы находитесь на странице: 1из 115

Плахотний Игорь

Николаевич
нач. отдела экспериментальных исследований,
экологической безопасности земель и качества
продукции Днепропетровского проектно-
технологического центра

+380964772507 , e-mail: igor_pin@mail.ru


URL: www.garryc2008.narod.ru
МИКОТОКСИНЫ.
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ.
 Основные представители
микотоксинов. Продуценты. Токсическое
действие.
Микотоксины (от греч. mukes - гриб и toxicon - яд) - это
вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов,
обладающие выраженными токсическими свой ствами. Они не
являются эссенциальными для роста и развития продуцирующих их
микроорганизмов.
В настоящее время из кормов и продуктов питания выделено
около 250 видов плесневых грибов, большинство из которых
продуцирует высокотоксичные метаболиты, в том числе около 120
микотоксинов. Предполагают, что с биологической точки зрения
микотоксины выполняют в обмене веществ микроскопических
грибов функции, направленные на выживание и
конкурентоспособность в различных экологических нишах.
С гигиенических позиций - это особо опасные токсические
вещества, загрязняющие корма и пищевые продукты. Высокая
опасность микотоксинов выражается в том, что они обладают
токсическим эффектом в чрезвычай но малых количествах и
способны весьма интенсивно диффундировать в глубь продукта.
Афлатоксины.
Афлатоксины представляют собой одну из наиболее опасных групп
микотоксинов, обладающих сильными канцерогенными свой ствами.
В эту группу входят более 15 микотоксинов. В настоящее время
семей ство афлатоксинов включает четыре основных представителя
(афлатоксины В1, В2, G1, G2) и еще более 10 соединений , являющихся
производными или метаболитами основной группы (М1, М2, В2а, G2a, GM1, Р1,
Q1 и другие). Высокой токсичностью обладают афлатоксины В1, В2, G1 и G2
(для афлатоксина B1 ЛД50 7,8 мг/кг, макаки, перорально).

Продуцентами афлатоксинов являются


некоторые штаммы 2 видов
микроскопических грибов: Aspergillus
flavus (Link.) и Aspergillus parasiticus
(Speare).
Физико-химические свой ства афлатоксинов. Афлатоксины обладают
способностью сильно флуоресцировать при воздей ствии длинноволнового
ультрафиолетового излучения. Афлатоксины В1 и В2 обладают сине-голубой
флуоресценцией , G1 и G2 - зеленой флуоресценцией , М1 и М2 - сине-фиолетовой .
Это свой ство лежит в основе практически всех физико-химических методов их
обнаружения и количественного определения.
Афлатоксины слаборастворимы в воде (10-20 мкг/мл), нерастворимы в
неполярных растворителях, но легко растворяются в растворителях средней
полярности, таких как хлороформ, метанол и др. В химически чистом виде они
относительно нестабильны и чувствительны к дей ствию воздуха и света,
особенно к ультрафиолетовому облучению. Растворы афлатоксинов стабильны
в хлороформе и бензоле в течение нескольких лет при хранении в темноте и на
холоде.
Мол. t пл., λ макс, Флуоресценция,
Микотоксин
масса °С нм * цвет, нм *

Афлатоксин B1 312 268-269 265,362 голубой , 425

Афлатоксин G1 328 244-246 - зелёный , 450

Афлатоксин M1 328 299 265,357 голубой, 425


* - Растворитель
метанол.
Афлатоксин В1: R=H
Mолекулярная масса – 312
Афлатоксин В2: R=H, положение 8
и 9 гидрированы
Mолекулярная масса – 314
Афлатоксин М1: R=OH
Mолекулярная масса – 328

Афлатоксин G1
Mолекулярная масса – 328
Афлатоксин G2: положения 9 и 10
гидрированы
Mолекулярная масса – 330
Следует обратить особое внимание на то, что афлатоксины практически не
разрушаются в процессе обычной кулинарной и технологической обработки
загрязненных пищевых продуктов.
Факторы, влияющие на токсинообразование. Продуценты афлатоксинов -
микроскопические грибы рода Aspergillus могут достаточно хорошо
развиваться и образовывать токсины на различных естественных субстратах
(продовольственное сырье, пищевые продукты, корма), причем не только в
странах с тропическим и субтропическим климатом, как полагали ранее, но
практически повсеместно, за исключением, быть может, наиболее холодных
рай онов Северной Европы и Канады.
Оптимальной температурой для образования токсинов является
температура 27-30°С, хотя синтез афлатоксинов возможен и при более низкой
(12-13°С) или при более высокой (40-42°С) температуре. Например, в условиях
производственного хранения зерна максимальное образование афлатоксинов
происходит при температуре 35-45°С, что значительно превышает
температурный оптимум, установленный в лабораторных условиях. Другим
критическим фактором, определяющим рост микроскопических грибов и
синтез афлатоксинов, является влажность субстрата и атмосферного воздуха.
Максимальный синтез токсинов наблюдается обычно при влажности выше
18% для субстратов, богатых крахмалом (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис,
кукуруза, сорго), и выше 9-10% - для субстратов с высоким содержанием
липидов (арахис, подсолнечник, семена хлопчатника, различные виды орехов).
При относительной влажности атмосферного воздуха ниже 85% синтез
афлатоксинов прекращается.
Механизм действия афлатоксинов.
Афлатоксины или их активные метаболиты дей ствуют практически на все
компоненты клетки. Афлатоксины нарушают проницаемость плазматических
мембран. В ядрах они связываются с ДНК, ингибируют репликацию ДНК,
ингибируют активность ДНК-зависимой -РНК-полимеразы - фермента,
осуществляющего синтез матричной РНК, и тем самым подавляют процесс
транскрипции. В митохондриях афлатоксины вызывают повышение
проницаемости мембран, блокируют синтез митохондриальных ДНК и белка,
нарушают функционирование системы транспорта электронов, вызывая тем
самым энергетический голод клетки. В эндоплазматическом ретикулуме под
воздей ствием афлатоксинов наблюдаются патологические изменения:
ингибируется белковый синтез, нарушается регуляция синтеза триглициридов,
фосфолипидов и холестерина. Афлатоксины оказывают прямое дей ствие на
лизосомы, что приводит к повреждению их мембран и высвобождению
активных гидролитических ферментов, которые, в свою очередь, расщепляют
клеточные компоненты. Все вышеперечисленные нарушения приводят к так
называемому метаболитическому хаосу и гибели клетки.
Одним из важных доказательств реальной опасности афлатоксинов для
здоровья человека явилось установление корреляции между частотой и
уровнем загрязнения пищевых продуктов афлатоксинами и частотой
первичного рака печени среди населения.
В природных условиях чаще и в наибольших количествах афлатоксины
обнаруживаются в арахисе, кукурузе, семенах хлопчатника. Кроме того, в
значительных количествах они могут накапливаться в различных орехах,
семенах масличных культур, пшенице, ячмене, зернах какао и кофе.
В кормах, предназначенных для сельскохозяй ственных животных,
афлатоксины также обнаруживаются достаточно часто и в значительных
количествах. Во многих странах с этим связано и обнаружение афлатоксинов в
продуктах животного происхождения. Например, в молоке и тканях
сельскохозяй ственных животных, получавших корма, загрязненные
микотоксинами, обнаружен афлатоксин М1 . Причем афлатоксин М1 обнаружен
как в цельном, так и в сухом молоке, и даже в молочных продуктах,
подвергшихся технологической обработке (пастеризация, стерилизация,
приготовление творога, й огурта, сыров и т. п.).
Согласно данным ВОЗ, человек при благоприятной гигиенической ситуации
потребляет с суточным рационом до 0,19 мкг афлатоксинов. У нас приняты
следующие санитарно-гигиенические нормативы по афлатоксинам: ПДК
афлатоксина В1 для всех пищевых продуктов, кроме молока, составляет -
5 мкг/кг, для молока и молочных продуктов - 1 мкг/кг (для афлатоксина М 1 - 0,5
мкг/кг). Допустимая суточная доза (ДСД) - 0,005-0,01 мкг/кг массы тела.
Охратоксины.
Охратоксины - соединения высокой токсичности, с ярко выраженным
тератогенным эффектом. В эту группу входят охратоксины А, В , С и
представляют собой группу близких по структуре соединений , являющихся
изокумаринами, связанными с L-фенилаланином пептидной связью.

Продуцентами охратоксинов являются


микроскопические грибы рода Aspergillus и Penicillium.
Основными продуцентами являются A. ochraceus и P.
viridicatum. Многочисленными исследованиями
показано, что природным загрязнителем чаще всего
является охратоксин А, в редких случаях охратоксин В.
Физико-химические свой ства. Охратоксин А -
бесцветное кристаллическое вещество, слабо
растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных
органических растворителях (метанол, хлороформ), а
также в водном растворе гидрокарбоната натрия. В
химически чистом виде он нестабилен и очень
чувствителен к воздей ствию света и воздуха, однако в
растворе этанола может сохраняться без изменений в
течение длительного времени.
Охратоксин А: R=H, R1=Cl
Mолекулярная масса – 403
Охратоксин B: R=H, R1=H
Mолекулярная масса – 369
Охратоксин C: R=Cl, R1=C2H5
Mолекулярная масса – 431

Мол. t пл., λ макс, Флуоресценция,


Микотоксин
масса °С нм * цвет, нм *

Охратоксин А 403 169 213,332 зелёный , 475

* - Растворитель
Охратоксин В
метанол. 369 221 218,318 голубой
В ультрафиолетовом свете обладает зеленой флуоресценцией . Охратоксин В
- кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора.
Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В ультрафиолетом
свете обладает голубой флуоресценцией . Охратоксин С - аморфное вещество,
этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве
природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В
ультрафиолетовом свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией .

Биологическое действие.
Охратоксины входят в группу микотоксинов, преимущественно
поражающих почки. При остром токсикозе, вызванном охратоксинами,
патологические изменения выявляются и в печени, и в лимфоидной ткани, и в
желудочно-кишечном тракте. В настоящее время уже доказано, что охратоксин
А обладает сильным тератогенным дей ствием. Вопрос о канцерогенности
охратоксинов для человека остается нерешенным.
Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы дей ствия
охратоксинов изучены недостаточно. В исследованиях in vitro показано, что они
активно связываются с различными белками: альбуминами сыворотки крови,
тромбином, альдолазой , каталазой , аргиназой , карбоксипептидазой А.
Некоторые моменты подтверждены и в исследованиях in vivo. Результаты
изучения влияния охратоксинов на синтез макромолекул свидетельствуют о
том, что охратоксин А ингибирует синтез белка и матричной РНК (токсин
дей ствует как конкурентный ингибитор), но не дей ствует на синтез ДНК.
Основными растительными субстратами, в которых обнаруживаются
охратоксины, являются зерновые культуры и среди них, в первую очередь,
кукуруза, пшеница, ячмень. С сожалением приходится констатировать тот факт,
что уровень загрязнения кормового зерна и комбикормов выше среднего во
многих странах (Канада, Польша, Югославия, Австрия), в связи с чем охратоксин
А был обнаружен в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). С
практической точки зрения весьма важно, что охратоксины являются
стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании
пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на
32% (при температуре 250-300°С).
Трихотеценовые микотоксины.
В настоящее время известно более 40 трихотеценовых микотоксинов
(ТТМТ). По своей структуре ТТМТ относятся к сесквитерпенам. Они содержат
основное ядро из трех колец, названное трихотеканом. В зависимости от
структуры трихотеценового ядра эти микотоксины подразделяются на 4
группы: А, В, С, Д. Структура различных типов трихотеценовых
микотоксинонов очень сложна и имеет свои характерные особенности.
Продуцируются грибами Fusarium sporotrichiella, Fusarium solani, Fusarium
graminearum и др. ЛД50 для этих микотоксинов (мыши, перорально) варьирует
от 6,7 мг/кг (токсин Т-2) до 46 мг/кг (дезоксиниваленол).
Токсин T-2: R1=OH, R2=R3=OAc, R4=H,
R5=OCOCH2CH(CH3)2
Mолекулярная масса – 424
Токсин HT-2: R1=R2=OH, R3=OAc, R4=H,
R5=OCOCH2CH(CH3)2
Mолекулярная масса – 466
Диацетоксискирпенол (ДАЗ): R1=OH, R2=R3=OAc,
R4=H, R5=CH2
Mолекулярная масса – 366

Ниваленол: R1=R2=R3=R4=OH
Mолекулярная масса – 312
Дезоксиниваленол (ДОН): R1=R3=R4=OH, R2=Н
Mолекулярная масса – 296
3-ацетил-дезоксиниваленол: R1=OAc, R2=Н, R3=R4=OH
Mолекулярная масса – 338
15-ацетил-дезоксиниваленол: R1=R4=OH, R2=Н, R3=OAc
Mолекулярная масса – 338
Фузаренон: R1=R3=R4= OH, R2=OAc
Mолекулярная масса – 354
Мол. t пл., λ макс, Флуоресценция,
Микотоксин
масса °С нм * цвет, нм *

Токсин Т-2 466 150-151 - ** -

Диацетоксискирпенол 366 162-164 - -

Дезоксиниваленол 296 151-153 218 -

Ниваленол 312 222-223 218 -


* - Растворитель метанол.
** - Отсутствие поглощения в УФ спектре или
флуоресценции.
ТТМТ - это бесцветные кристаллические, химически стабильные
соединения, плохо растворимые в воде. ТТМТ типа А растворимы в умеренно
полярных растворителях (ацетон, хлороформ), типа В - в более полярных
растворителях (этанол, метанол и др.). Эти токсины, за исключением некоторых,
не обладают флюоресценцией . В связи с этим, для их обнаружения, после
разделения методом тонкослой ной хроматографии, используют различные
способы (например, нагревание до 100- 150°С после обработки спиртовым
раствором серной кислоты) с целью получения окрашенных или
флуоресцирующих производных.

Биологическое действие ТТМТ.


Алиментарные токсикозы, вызванные потреблением в пищу пищевых
продуктов и кормов, пораженных микроскопическими грибами,
продуцирующими ТТМТ, можно отнести к наиболее распространенным
микотоксикозам человека и сельскохозяй ственных животных. Первые сведения
о такого рода заболеваниях появились более ста лет тому назад.
Продуцентами ТТМТ типа А и В, обладающих высокой токсичностью,
являются многие грибы рода Fusarium. Микроскопические грибы этого рода
являются возбудителями так называемых гнилей корней , стеблей , листьев,
семян, плодов, клубней и сеянцев сельскохозяй ственных растений . Таким
образом, поражаются корма и пищевые продукты, и как следствие наблюдается
возникновение алиментарных токсикозов у животных и человека.
Хорошо известен токсикоз "пьяного хлеба" - заболевание человека и
животных, причиной которого послужило употребление зерновых продуктов
(главным образом хлеба), приготовленных из зерна, пораженного грибами
Fusarium graminearum (F. roseum). Кроме того, описан целый ряд тяжелых
токсикозов, таких как алиментарная токсическая алей кия - АТА (токсикоз,
связанный с употреблением в пищу продуктов из зерновых культур,
перезимовавших в поле под снегом и пораженных микроскопическими грибами
F. sporotrichiella) и многие другие, приводящие к серьезному нарушению
здоровья людей и протекающие по типу эпидемий , т. е. характеризующиеся
определенной очаговостью, сезонностью, неравномерностью вспышек в разные
годы и употреблением продуктов из зерна, пораженного микроскопическими
грибами. Многочисленными исследованиями in vitro и in vivo было показано, что
ТТМТ являются ингибиторами синтеза белков и нуклеиновых кислот, кроме
этого, вызывают нарушения стабильности лизосомных мембран и активацию
ферментов лизосом, что в конечном счете приводит к гибели клетки.
В качестве природных загрязнителей пищевых продуктов и кормов
обнаружены лишь четыре из более чем четырех десятков трихотеценовых
микотоксинов. Чаще всего они обнаруживаются в зерне кукурузы, пшеницы и
ячменя. Микотоксины этой группы отличаются повсеместным
распространением, причем в большей степени это касается многих стран
Европы, Северной Америки, в меньшей - Индии, Японии, Южной Америки.
Необходимо отметить, что часто в одном и том же продукте обнаруживают
два или более микотоксинов.
Зеараленон и его производные
Зеараленон и его производные также продуцируются микроскопическими
грибами рода Fusarium. К этой группе относят 15 микотоксинов. Основными
продуцентами зеараленона являются Fusarium graminearum и F. roseum. Он
впервые был выделен из заплесневелой кукурузы. По своей структуре
зеараленон является лактоном резорциловой кислоты. Для зеараленона ЛД50 10
000 мг/кг (крысы, перорально). Он взаимодей ствует с эстрадиолсвязывающими
рецепторами в клетках-мишенях. Обладает эстрогенными свой ствами, а также
антибактериальным дей ствием в отношении грамположительных бактерий . В
качестве природных загрязнителей встречаются только зеараленон и
зеараленол.
Зеараленон - белое кристаллическое вещество, плохо растворимое в воде, но
хорошо растворимое в этаноле, ацетоне, метаноле, бензоле. Имеет три
максимума поглощения в ультрафиолете (236 нм, 274 нм, 316 нм) и обладает
сине-зеленой флуоресценцией .

Группа VII
Зеараленон: X= CO
Mолекулярная масса – 318
Зеараленол: X= CHOH
Mолекулярная масса – 312

Биологическое действие
Зеараленон обладает выраженными гормоноподобными (эстрогенными)
свой ствами, что отличает его от других микотоксинов. Кроме этого, в опытах
на различных лабораторных животных было доказано тератогенное дей ствие
зеараленона, хотя он и не обладает острым (летальным) токсическим
эффектом даже при введении его животным в очень больших дозах. Сведения о
влиянии зеараленона на организм человека отсутствуют, но, учитывая его
высокую эстрогенную активность, нельзя полностью исключить негативное
воздей ствие зеараленона на организм человека.
Основным природным субстратом, в котором наиболее часто обнаруживается
зеараленон, является кукуруза. Поражение кукурузы микроскопическими
грибами рода Fusarium - продуцентами зеараленона - происходит как в поле, на
корню, так и при ее хранении. Высока частота обнаружения зеараленона в
комбикормах, а также в пшенице и ячмене, овсе.
Тепловая обработка в ней тральной или кислой среде не разрушает
зеараленон, но в щелочной среде при 100°С за 60 мин разрушается около 50%
токсина. К разрушению зеараленона приводит и обработка загрязненной
кукурузы 0,03% раствором персульфата аммония или 0,01% раствором
пероксида водорода.
С практической точки зрения интересными представляются данные по
влиянию переработки зерна кукурузы на степень загрязнения зеараленоном. В
крупке и муке грубого помола, без удаления отрубей , в муке, полученной при
сухом помоле кукурузы, содержание зеараленона составляло примерно 20% от
его количества в цельном зерне. При влажном помоле загрязненной кукурузы
токсин концентрировался во фракции клей ковины, где его концентрация была
выше, чем в отрубях и зародыше; во фракции крахмала токсин не выявлялся.
Патулин
Микотоксины, продуцируемые микроскопическими грибами рода Penicillium,
распространены повсеместно и представляют реальную опасность для здоровья
человека. Патулин особо опасный микотоксин, обладающий канцерогенными и
мутагенными свой ствами. Он впервые был выделен в 1943 году как антибиотик.
ЛД50 17-36 мг/кг (мыши, перорально). Обладает высокими мутагенными
свой ствами. Ингибирует синтез белка, ДНК, РНК, ферменты, содержащие в
активном центре группы SH. Основными продуцентами патулина являются
микроскопические грибы Penicillium patulum и Penicillium expansum. Но и другие
виды этого рода микроскопических грибов, а также Byssochlamys fulva и В. nivea
способны синтезировать патулин. Максимальное токсинообразование
отмечается при температуре 21-30°С.
По своей химической структуре патулин представляет 4-гидроксифуропиран. Он
имеет один максимум поглощения в ультрафиолетовой области при 276 нм.

Группа VI
Патулин
Mолекулярная масса – 153

Биологическое действие
Биологическое дей ствие патулина проявляется как в виде острых токсикозов,
так и в виде ярко выраженных канцерогенных и мутагенных эффектов.
Биохимические механизмы дей ствия патулина изучены недостаточно.
Предполагают, что патулин блокирует синтез ДНК, РНК и белков, причем
блокирование инициации транскрипции осуществляется за счет
ингибирования ДНК-зависимой -РНК-полимеразы. Кроме этого, микотоксин
активно взаимодей ствует с SH-группами белков и подавляет активность
тиоловых ферментов. Продуценты патулина поражают в основном фрукты и
некоторые овощи, вызывая их гниение. Патулин обнаружен в яблоках, грушах,
абрикосах, персиках, вишне, винограде, бананах, клубнике, голубике, бруснике,
облепихе, ай ве, томатах. Наиболее часто патулином поражаются яблоки, где
содержание токсина может доходить до 17,5 мг/кг. Интересно, что патулин
концентрируется в основном в подгнившей части яблока, в отличие от томатов,
где он распределяется равномерно по всей ткани.
Патулин в высоких концентрациях обнаруживается и в продуктах
переработки фруктов и овощей : соках, компотах, пюре и джемах. Особенно часто
его находят в яблочном соке (0,02-0,4 мг/л). Содержание патулина в других
видах соков: грушевом, ай вовом, виноградном, сливовом, манго - колеблется от
0,005 до 4,5 мг/л.
***
В нашей стране наиболее часто встречаются микотоксины: ДОН, или
вомитоксин, Т-2 токсин, зеараленон и афлатоксин. Нередки случаи
обнаружения охратоксина А. Ими чаще всего бывают контаминированы
зерновые, а также соевые и подсолнечниковые шроты и жмыхи, в том числе
при хранении и продолжительной транспортировке. Причины появления и
интенсивного роста грибов в период вегетации и созревания культур,
особенно за несколько недель до уборки, еще до конца не выяснены.
В последнее десятилетие получены данные о том, что некоторые
фунгициды, в частности тебуконазол и флуконазол, примененные в
недостаточной концентрации, не уменьшали, а наоборот, усиливали
контаминацию зерна вомитоксином (ДОН). А недавние исследования,
проведенные в Великобритании, показали, что фунгицид азоксистробин,
угнетая рост неопасной плесени, одновременно способствовал замещению ее
токсиногенными видами грибов рода Fusarium.
Методические направления идентификации
и количественного определения
микотоксинов
Проблема правильного определения количества микотоксинов
заключается в том, что микотоксины, как правило, крайне неравномерно
распределяются в массе зерна или комбикорма. В местах роста плесени
концентрация микотоксинов может быть очень высокой. Даже самый
лучший современный метод анализа не выявит токсичность, если не
будет соблюдена трудоемкая рутинная процедура отбора проб.
Показателен пример, продемонстрированный на Всемирном форуме
по микотоксинам в Нидерландах. Ниже представлены результаты
анализа 10 проб пищевого арахиса по 5 кг каждая, отобранных из одной
партии.
Содержание афлатоксина В1 в зазных пробах арахиса одной партии

Проба Содержание афлатоксина В1


(мкг/кг)

1 0

2 3

3 13

4 0

5 19

6 41

7 43

8 0

9 0
То есть, если специалист будет считать, что образец в 5 кг, отобранный из
одного места, достаточно полно отражает качество партии продукта, анализ
микотоксинов окажется простой тратой денег и времени. Один из наиболее
совершенных и удачных методов отбора проб для анализа на содержание
афлатоксина В1 описан в Директиве ЕС.

Из таблицы видно, что из партии в 100 т рекомендовано отобрать 30 кг


продукта. Далее они должны быть разделены на три равные части (по 10 кг),
тонко помолоты и снова тщательно перемешаны. Только после этого могут быть
отобраны образцы для лабораторного анализа, обычно массой 50-200 г.
Самая точная аналитическая техника может дать неверное представление о
качестве продукта, если не будет применена схема подготовки образца. Однако
схема отбора проб, подобная вышеописанной , подчас просто неприемлема на
практике.
В настоящее время из простых методов определения наличия микробных
токсинов в кормах наиболее распространен анализ общей токсичности кормов
по выживанию простей ших микроорганизмов (парамеции, стилонихии,
калподы). К сожалению, такой простой метод ничего не говорит о природе
токсичности. Это всего лишь качественный индикатор присутствия в корме
каких-либо вредных для здоровья компонентов: тяжелых металлов, пестицидов,
микотоксинов и т.д. Метод кожной пробы (мыши, кролики и др.) хотя и более
адекватен в данном случае, также не раскрывает причину токсичности. К тому
же он трудоемок и долог (5-7 дней ), что резко ограничивает его практическое
применение.
Современные методы обнаружения и определения содержания микотоксинов
в пищевых продуктах и кормах включают скрининг-методы, количественные
аналитические и биологические методы.
Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серий ных
анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и
незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные
методы, как метод тонкослой ной хроматографии для одновременного
определения до 30 различных микотоксинов, флуоресцентный метод
определения зерна, загрязненного афлатоксинами, иммуноферментный
экспресс-метод, и некоторые другие.
Количественные аналитические методы определения микотоксинов
представлены химическими и иммуноферментными методами. Химические
методы являются в настоящее время наиболее распространенными и состоят из
двух стадий : стадии выделения и стадии количественного определения
микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение
микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с
близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение
микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов,
таких как газожидкостная хроматография (ГЖХ), тонкослой ная хроматография
(ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-
спектрометрия. Количественную оценку содержания микотоксинов проводят
путем сравнения интенсивности флуоресценции при ТСХ в ультрафиолетовой
области спектра со стандартами. Для подтверждения достоверности
полученных результатов применяют различные тесты, основанные на
получении производных микотоксинов с иными хроматографическими,
колориметрическими или флюорометрическими характеристиками.
Высокочувствительные и высокоспецифичные иммуноферментные методы
обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов
находят все более широкое применение и пользуются повышенным вниманием
со стороны исследователей . Эти методы основаны на получении антисывороток
к конъюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Основным
преимуществом этих методов является их исключительная чувствительность.
Варианты пробоподготовки при определении микотоксинов
Подготовка проб для анализа является край не необходимой процедурой ,
поскольку в большинстве случаев нельзя использовать непосредственно
исходный материал, иногда еще нужно проводить очистку загрязненного
образца, преконцентрацию анализируемой субстанции. Следует отметить, что
такие процедуры достаточно важны, так как в значительной степени влияют
на окончательный результат анализа. Они имеют ряд особенностей для
конкретных обследуемых объектов, анализируемых веществ и используемых
методик.

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ

АФЛАТОКСИН В1

(Общий принцип): К 25 г навески добавляют 25 мл 10% раствора хлорида


натрия и 100 мл ацетона (ацетонитрила). Экстракция в течение 30 минут, затем
фильтрация. Для дальней шей очистки используют 50 мл фильтрата. Вариантов
очистки имеется два : 1- депротеинизация белоксодержащих экстрактов из
орехов, хлебобулочных изделий и т.д. растворами ацетата свинца или Кареза
(сульфат цинка+ феррицианид калия+ тетраборат натрия). Потом реэкстракция
в хлороформ. 2. – колоночная хроматография на силикагеле или флоризиле.
(Вариации из зарубежных стандартизированных источников):
Экстракция афлатоксинов с использованием хлороформа Метод СВ
(АОАС и ЕЕС) экстракции афлатоксинов
50 г тонко измельченного образца смешивают с 25 г диатомовой земли
(породу, которая называется диатомит - рыхлые кремнистые отложения,
состоящие из панцирей диатомовых водорослей ). Смесь увлажняют
добавлением 25 г воды, затем тщательно перемешивают и разводят в 250 мл
хлороформа, после чего интенсивно взбалтывают на вибрационном шей кере в
течение 30 мин. Порцию хлороформного экстракта объемом 50 мл отбирают
для дальней шей очистки и анализа. Добавление воды способствует
проникновению хлороформа в растительный субстрат, в то время как
диатомовая земля удерживает различные вещества, такие, например, как
пигменты.
Метод экстракции афлатоксинов согласно § 35 «Lebensmittel und
Bedaffspeyenstands Gasetz” (LMBG)
20 г тонко измельченного образца смешивают с 20 г силикагеля с размером
частиц 20-45 мкм (например, celit 545, Serva, Германия). Эту смесь разводят в
200 мл хлороформа и 20 мл воды, затем интенсивно взбалтывают на
вибрационном шей кере в течение 30 мин. После фильтрации отбирают 100 мл
экстракта и выпаривают до сухого остатка на ротационном испарителе
(температура 40 ° С).
Очистка афлатоксинов
Метод согласно предписаниям АОАС/ЕЕС и §35 LMBG
Стеклянную колонку (40 х 300 мм) заполняют последовательно 5 г сульфата
натрия, 10 г силикагеля (63-200 мкм, высушенного при 105 ° С), 15 г безводного
сульфата натрия и прикрывают ватой . Экстракт, который следует очистить,
наливают сверху, затем элюируют 15-20 мл хлороформа. После этого колонку
обрабатывают 150 мл гексана и 150 мл диэтилового эфира для того, чтобы
вымыть из афлатоксинов липиды и другие подобные им вещества. Афлатоксины
элюируют 150 мл смеси хлороформа и метанола (97:3). Затем элюат высушивают
и опять разводят в растворителе, который пригоден для ВЭЖХ-анализа (метанол).

Одним из вариантов, дающих воспроизводимые результаты можно привести


технологию экстрагирования афлатоксинов фирмы CAMAG, приводимой в
стандартизированной методике под шифром А-12.4Е .

5,6 г измельченного образца гомогенизируют со 100 мл метанола в течение 3


минут. Затем к смеси добавляют 40 мл воды, перемешивают еще 4 минуты и дают
постоять 10 минут. Фильтуют и отбирают 20 мл фильтрата. К аликвоте фильтрата
добавляют 20 мл 10% раствора хлорида натрия и 20 мл петролей ного эфира.
Встряхивают в течение 2 минут, дают расслоиться фазам в течение 10 минут.
Петролей ную фазу отделяют с помощью делительной воронки и отбрасывают.
Афлатоксины переэкстрагируют из водно-метанольного экстракта 50 мл
дихлорметана однократно, встряхивая 1 минуту. Отделяют дихлорметановую
фазу, сушат 5 г сульфата натрия и упаривают.
В случае сильно пигментированных проб, типа порошка из паприки,
производят дополнительную очистку одним из предложеных ниже методов :

1а Очистка на силикагельном картридже для ТФЭ: Промыть патрон 6 мл


толуол - ацетонитрил 98:2. (не допуская высыхания сорбента!). Нанести
предварительно растворенный образец в 0,5 мл толуол - ацетонитрил 98:2 , дать
впитаться и промыть последовательно 20 мл толуол – уксусная кислота 9:1 и 20
мл гексан – диэтиловый эфир - ацетонитрил 6:3:1 (Сорбент продуть воздухом для
удаления растворителей ). Элюировать афлатоксины 11 мл дихлорметан - ацетон
3:1.

2а Элюат упарить и растворить в 0.5 мл подходящего растворителя.

1в Очистка на RP-18 картридже для ТФЭ: Промыть патрон 2 мл метанола,


высушить и кондиционировать 4 мл смеси метанол - вода 2:8 и 2 мл воды. (не
допуская высыхания сорбента!). Нанести предварительно растворенный образец
в 0,5 мл метанола , дать впитаться и промыть 5 мл метанол - вода 2:8, просушить
1 минуту. Элюировать афлатоксины 4 x 2.5 мл метанол – вода 1:1.

2в Встряхнуть водно-метанольный элюат 1 мин с 20 мл NaCl (10%) и 18 мл


дихлорметана , дать расслоиться фазам в течение 5 минут. Отделить
дихлорметановую фазу. Повторить экстрагирование 2 мл дихлорметана.

3в Элюат упарить и растворить в 0.5 мл подходящего растворителя.


ЗЕАРАЛЕНОН

(Общий принцип) : Из подготовленной для испытания пробы зерна отбирают


навеску массой 50 г и помешают в колбу вместимостью 500 мл. В колбу вносят
180 мл ацетонитрила и 20 мл 4% раствора хлорида калия, встряхивают на
шуттель-аппарате 30 минут (либо оставляют на 18—20 ч при комнатной
температуре). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу.
(Очистка) : Полученный фильтрат очищают. 100 мл фильтрата помещают и
делительную воронку, где фильтрат четырехкратно обезжиривают гексаном по
50 мл каждый раз. Очищенную {нижнюю) фазу ацетонитрила переносят либо в
колбу роторного испарителя, либо в выпарительную чашку и выпаривают
досуха при температуре 80°С. К полученному сухому остатку добавляют 20 мл
ацетонитрила, 60 мл воды и 20 мл раствора уксуснокислого свинца.
Перемешивают и ставят в водяную баню на 10—15 мин при температуре 80°С до
образования осадка или помутнения. Затем добавляют 5 г силикагеля АСК (или
целита), перемешивают и фильтруют через фильтровальную бумагу. 50 мл
фильтрата помещают в делительную воронку и проводят трой ную
переэкстракцию хлороформом по 50 мл каждый раз. Хлороформную фракцию
(нижнюю) собирают в выпарительную чашку и упаривают досуха на водяной
бане при температуре 80°С. Сухой остаток растворяют 5 мл хлороформ,
количественно переносят в пробирку с притертой пробкой и упаривают досуха
на водяной бане.
(Вариации на тему очистки экстракта) :

Экстракт очищают с помощью колоночной хроматографии. В нижнюю часть


колонки помещают тампон ваты высотой 1 см, вносят 7 г окиси алюминия и
пропускают через колонку 20 мл ацетона. Сухой остаток растворяют в 20 мл
ацетона и помещают в колонку. После того как экстракт опустится до верхней
поверхности столбика адсорбента, через колонку пропускают последовательно
30 мл ацетона и 100 мл смеси ацетон—дистиллированная вода, взятых в
соотношении 99 : 1, для удаления примесей . Зеараленон элюируют 200 мл
0,005 н. водного раствора гидроокиси натрия в фарфоровую чашку, и элюат
выпаривают на кипящей водяной бане досуха. Полученный после выпаривания
щелочного раствора остаток в чашке тщательно смывают (3—4 раза) порциями
ацетона по 10 мл и фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую чашку или
остродонную колбу для упаривания на ротационном испарителе. Фильтрат
упаривают досуха. Остаток растворяют в 0,5—1,0 мл подходящего растворителя.
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ (ДОН)

(Общий принцип) : Навеску исследуемого продукта массой (25 ± 0.05) г помещают


в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 мл приливают 20 мл
билистиллированной воды и затем 105 мл ацетонитрила. Колбу закрывают
пробкой и встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин.
После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр
в колбу с притертой пробкой .
(Очистка) : 5 мл фильтрата переносят в колонку 1 (0,2 г активированного угля)
и элюируют в остролонную колбу вместимостью 50 мл со скоростью не более
0.5 мл/мин. С целью ускорения элюирование можно проводить с помощью
вакуума водоструй ного насоса. Не допуская осушения сорбента, через колонку
пропускают 15 мл ацетонитрила, собирая элюат в ту же остродонную колбу. По
окончании элюирования из колбы с помощью ротационного вакуумного
испарителя при температуре не более 60 °С полностью отгоняют растворитель.
К сухому остатку добавляют 1 мл билистиллированной воды. Колбу закрывают
пробкой и ее стенки осторожно споласкивают находящей ся в ней жидкостью.
Содержимое колбы с помошью пипетки переносят в колонку 2 (0,1 г
активированного угля). Стенки колбы повторно обмывают 1 мл
билистиллированной воды, которую также переносят в колонку 2. Колонку 2
промывают 2 мл билистиллированной воды и элюат отбрасывают. Из колонки 2
дезоксиниваленол элюируют 7,5 мл ацетонитрила в остродонную колбу
вместимостью 25 мл. Собранный элюат упаривают досуха с помощью
ротационного вакуумного испарителя.
(Вариации на тему очистки экстракта) :
А). В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты,
насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху - слой 0,75 г оксида
алюминия. Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты.
Осторожно наливают в колонку объем экстракта, соответствующий 5 г
исходного образца. Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть,
добавляют 10 мл смеси ацетонитрил - вода (84:16). Объединенные элюаты
фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50
мл, бумажный фильтр промывают 5 - 10 мл изопропилового спирта в ту же
колбу и фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 - 7 мл.
Добавляют около 20 мл изопропилового спирта и повторно упаривают на
ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен
содержать капель воды. Остаток растворяют в 0,2 мл подходящего
растворителя.

Б). В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты.


Навеску силикагеля 10,0±0,1 г в стакане заливают 15 мл бензол—ацетон в
объемном соотношении 8:2, взмучивают, встряхивая содержимое стакана
круговыми движениями 3—4 раза и полученную взвесь резко вливают через
воронку в стеклянную колонку при открытом кране. Когда высота слоя
растворителя над поверхностью силикагеля достигнет 1 см, в колонку всыпают
по 2,0±0,1 г сульфата натрия. Растворы сухого остатка экстракта (всего!) в 20 мл
смеси бензола—ацетона в объемном соотношении 8 : 2 и смывы с колб 2х15 мл
той же смесью последовательно пропускают через колонку.
Элюаты отбрасывают, а затем элюируют ДОН последовательно 50 мл смесью
бензол—ацетон в объемном соотношении 7:3 и 25 мл смеси тех же
растворителей в соотношении 6: 4. Полученные элюаты (75 мл) упаривают
досуха в вакууме при 50 °С и затем растворяют в 2 мл подходящего
растворителя.

С). В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек


ваты, затем насыпают 1,2 г сорбента К-2 (смесь диатомита марки Порохром 1 М с
активированным углем (70,6 г диатомита марки Порохром 1 М (0,25— 0,315 мм)
и 29,4 г измельченного активированного угля марки АГ-3)). Сверху на сорбент
насыпают 4 г оксида алюминия. Кондиционируют колонку 5 мл экстракционной
смеси (ацетонитрил:вода в соотношении 5:1), элюат отбрасывают. Затем не
давая высохнуть сорбенту, через колонку пропускают 20 мл ацетонитрильного
экстракта до упаривания и последовательно после впитывания экстракта
колонку промывают 5 мл экстракционной смеси (ацетонитрил:вода в
соотношении 5:1). Все элюаты собирают и упаривают. Остаток растворяют в 0,5
мл подходящего растворителя.
ТОКСИН Т-2

(Общий принцип) : Навеску измельченной пробы зерна массой 20 г помещают


в плоскодонную коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляют 10 мл
4%-ного раствора хлорида калия и 90 мл ацетонитрила. Встряхивают на
аппарате для встряхивания 30 мин. Полученную смесь фильтруют через
бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирают 70 мл фильтрата
(соответствует 14 г исходного образца).

Или :
Из подготовленной для испытания пробы зерна отбирают навеску массой 25 г и
помещают в колбу вместимостью 500 мл. В колбу вносят 150 мл ацетона и
встряхивают на шуттель-аппарате 1,5 ч (либо оставляют на 18—20 ч при
комнатной температуре). Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу,
а остаток еще раз заливают 100 мл ацетона, вновь встряхивают 30 мин и
фильтруют через тот же фильтр в соответствующую колбу. Фильтр промывают
10 мл ацетона, присоединяя фильтрат к общему ацетоновому экстракту,
который переносят в делительную воронку. К ацетоновому экстракту
добавляют 25 мл гексана, перемешивают и добавляют 50 мл воды. После
разделения слоев гексановую фракцию (верхний слой ) удаляют, а нижний слой
(водно-ацетоновая фракция) повторно экстрагируют 25 мл гексана при
перемешивании растворов. Выделивший ся после отстаивания смеси верхний
гексановый слой снова удаляют.
(Очистка) :
В делительную воронку на 250 мл помещают 70 мл фильтрата, добавляют
50 мл гексана, после встряхивания и разделения слоев верхний гексановый
слой отбрасывают. Нижний ацетонитрильный слой еще дважды встряхивают с
40 мл гексана, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой . Если слои
плохо разделяются, добавляют сульфат аммония. К ацетонитрильному слою
добавляют 2 - 3 мл бензола и сульфат аммония на кончике шпателя,
встряхивают и отбрасывают нижний водный слой . Ацетонитрильный слой
помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха с добавлением
изопропанола до объема 1 мл.
Или :
Водно-ацетоновую фракцию экстрагируют 25 мл хлороформа. Содержимое
перемешивают 2 мин и оставляют для разделения слоев. После разделения слоев
хлороформную фракцию (нижний слой ) собирают в отдельную колбу, а затем
пропускают через подготовленную хроматографическую колонку. Очищенный на
колонке от примесей экстракт собирают в колбу для отгона или выпарительную
чашку. Экстракцию водно-ацетоновой фракции хлороформом проводят еще два
раза, экстрагируя каждый раз 20 мл хлороформа и пропуская каждую порцию
экстракта через хроматографическую колонку. Экстракты, очищенные на
колонке, собирают вместе в колбе для отгона или выпарительной чашке. Затем
колонку три раза промывают хлороформом по 30 мл с последующим
присоединением промывных порций к основному экстракту, находящемуся в
колбе для отгона.
Хроматографическую колонку заполняют в следующей последовательности:
вначале помешают тампон гигроскопической ваты, затем 1 г силикагеля, 2 г окиси
алюминия и 2 г окиси кальция. Силикагель и окись алюминия вносят небольшими
порциями, слегка постукивая по колонке. Для удаления пузырьков воздуха
промывают колонку небольшим количеством хлороформа (15—20 мл) при
отсасывании водоструй ным насосом. Окись кальция вносят в колонку в виде
хлороформной суспензии при отсасывании водоструй ным насосом.
ОХРАТОКСИН А

(Общий принцип) : Навеску 25 г отобранной измельченной пробы помещают


в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 12,5 мл 1%
раствора уксусной кислоты (в некоторых источниках - ортофосфорной кислоты)
в воде и 125 мл хлороформа. Встряхивают на аппарате для встряхивания в
течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый
фильтр в мерный цилиндр вместимостью 100 мл, отбирают 50 мл
фильтрата.

Или :

Экстракция охратоксинов с использованием толуола, согласно § 35 LMBG,


метод 15-00-1, АОАС 26.100-26.125

Смесь 30 мл 2М НСL и 50 мл 0,4М раствора хлорида магния прибавляют к 20 г


измельченного образца. После гомогенизации приливают 100 мл толуола,
полученную смесь интенсивно взбалтывают в течение 60 мин. Суспензию
разделяют на центрифуге, отбирают 50 мл жидкости над осадком и пропускают
через предварительно подготовленную кварцевую колонку Sер Рак. Колонку
обрабатывают двумя 10 мл аликвотами гексана, 10 мл смеси толуола и ацетона
(95:5), а также 5 мл толуола. Охратоксин А элюируют двумя порциями по 15 мл
каждая, смеси толуола и уксусной кислоты (9:1). Элюат высушивают при 40 ° С.
Остаток растворяют в 1 мл подходящего растворителя.
(Очистка) :
В делительную воронку переносят 50 мл фильтрата, добавляют 35 мл 3%
раствора гидрокарбоната натрия в смеси метанол - вода (1:4). Встряхивают,
после разделения слоев верхний водный слой отделяют. Нижний
хлороформный слой экстрагируют (2 раза по 35 мл) водно-метанольным
раствором гидрокарбоната натрия. Объединенные водные экстракты
встряхивают в делительной воронке с хлороформом (2 х 25 мл), каждый раз
после разделения слоев отбрасывая нижний хлороформный слой . Водный
экстракт подкисляют раствором серной кислоты в воде с концентрацией 2
моль/л до pH 2 - 3 по универсальной индикаторной бумаге (примерно 9,5 - 10
мл раствора серной кислоты). Подкисленный водный раствор немедленно
экстрагируют в делительной воронке хлороформом (1 раз по 50 мл и 2 раза по
25 мл). Объединенные хлороформные экстракты сушат безводным сульфатом
натрия (10 - 12 г) в течение 0,5 ч. Раствор порциями фильтруют через
химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу, осушитель
промывают 15 мл хлороформа, который также фильтруют в ту же колбу, и
раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре
водяной бани не выше 40 – 45 °С. Остаток растворяют в 0,4 мл подходящего
растворителя.
ПАТУЛИН

(Общий принцип) : Навеску сока массой 50 г или фруктового порошка массой


25 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с небольшим количеством
дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу
вместимостью 250 мл. В мерную колбу вносят 15 мл раствора Карреза I и
15 мл раствора Карреза II. Содержимое колбы доводят дистиллированной
водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный
цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Отбирают 50 мл фильтрата, в
полученный фильтрат вводят 1 г гидрохлорида гидроксиламина, содержимое
цилиндра перемешивают и настаивают в течение 15 мин. Затем переносят в
делительную воронку, добавляют 50 мл этилацетата и смесь интенсивно
встряхивают. После разделения слоев отделяют верхний этилацетатный слой
и переносят его в сухую плоскодонную колбу. Затем экстракцию проводят еще
раз со свежей порцией этилацетата. Если полного расслоения жидкостей не
происходит, в делительную воронку добавляют 10 - 12 г хлорида натрия и
смесь слегка встряхивают. Этилацетатные экстракты объединяют, сушат
безводным сульфатом натрия и фильтруют через кусочек ваты в
грушевидную колбу. Сульфат натрия промывают 10 мл этилацетата и
фильтруют в ту же колбу. Экстракт упаривают на ротационном испарителе
досуха. Остаток растворяют в 1 мл этилацетата.
(Очистка) :
В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты
и 5 мл бензола, насыпают слой безводного сульфата натрия (5 мм) и наливают
суспензию 2 г (3,6 мл) силикагеля в 15 мл бензола. Не давая колонке просохнуть
(колонка закрыта снизу), насыпают слой безводного сульфата натрия (10
мм). Бензолу дают стечь, на верхний слой сорбента наносят экстракт, дают
впитаться в фильтрующий слой . Отгонную колбу ополаскивают 5 мл
этилацетата, переносят раствор на колонку и дают этилацетату полностью
впитаться в фильтрующий слой . Колонку промывают 25 мл бензола. Патулин
элюируют 75 мл смеси этилацетат - бензол (25:75). Элюат упаривают досуха
на ротационном испарителе. Остаток растворяют в 0,2 мл подходящего
растворителя.
(Вариации на тему экстракции) :

Навеску сока массой 50 г помещают в стеклянный стакан, смешивают с


небольшим количеством дистиллированной воды, затем количественно
переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл. В мерную колбу вносят 2 мл
концентрированной соляной кислоты, 15 мл раствора гексациано-(II)-феррата
калия с концентрацией 150 г/л и 15 мл раствора уксуснокислого цинка с
концентрацией 300 г/л. Содержимое колбы доводят дистиллированной водой до
метки, тщательно перемешивают и фильтруют в мерный цилиндр через плотный
складчатый фильтр. Отфильтровывают 50 мл раствора. Фильтрат из цилиндра
переносят в делительную воронку. Этим же цилиндром отмеряют 50 мл
этилацетата, переносят его в делительную воронку и затем 1-2 мин интенсивно
перемешивают содержимое. Смеси дают отстояться, после полного разделения
слоев водный слой сливают обратно в цилиндр, а этилацетатный экстракт
переносят в плоскодонную колбу с притертой пробкой . Экстрагирование в
аналогичных условиях свежими порциями этилацетата проводят еще 2 раза.
Этилацетатные экстракты объединяют и сушат в колбе с притертой пробкой
безводным сернокислым натрием (приблизительно 10 г) в течение 10-15 мин.
Затем экстракт фильтруют через вату в отгонную колбу. Колбу с сернокислым
натрием ополаскивают 15 мл этилацетата, которые затем также
отфильтровывают в отгонную колбу. В экстракт вводят 1 г силикагеля. Экстракт
упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более
40°С. Концом упаривания считают момент, когда силикагель начинает свободно
пересыпаться.
(Очистка. Вариации) :
Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно
стеклянной колонки помещают кусочек ваты, на нее наливают суспензию,
содержащую 2 г силикагеля в 20 мл толуола. Толуолу дают стечь, и, не допуская
просыхания силикагеля, на него наливают еще 20 мл толуола. На
хроматографическую колонку, находящуюся под слоем толуола, насыпают
силикагель с адсорбированным экстрактом из отгонкой колбы. Через колонку
пропускают еще 100 мл толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Отгонную
колбу ополаскивают 5 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 2:3 и выливают
раствор в колонку, куда приливают еще 100 мл смеси гексан-этилацетат (2: 3).
Весь элюат собирают и упаривают в грушевидной колбе на ротационном
испарителе при температуре водяной бани не более 40°С досуха. В колбу вводят 4
мл хлороформа, 50 мг сорбента типа "силасорб амин" и аккуратно перемешивают.
Содержимое колбы переносят на ватный тампон, вставленный в горло
стеклянной воронки. Остатки сорбента на стенках колбы смывают еще двумя
порциями хлороформа по 3 мл на ватный тампон. Сорбент дополнительно
промывают 30 мл хлороформа. Весь хлороформный элюат собирают в отгонную
колбу, куда добавляют 50 мкл раствора n-ацетаминофенола в хлороформе,
используемого в качестве внутреннего стандарта. Полученный раствор
анализируют с использованием ВЭЖХ.
ИННОВАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРОБ ПРИ
АНАЛИЗЕ НА СОДЕРЖАНИЕ МИКОТОКСИНОВ ОТ
НПО «АКВИЛОН»
АФЛАТОКСИНЫ
ЗЕАРАЛЕНОН
ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ и ТОКСИН Т-2
ОХРАТОКСИН А
ПАТУЛИН
УНИВЕРСАЛИЗОВАННЫЕ МЕТОДЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ ПРОБ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТФЭ ПАТРОНОВ ОТ НПО «БИОХИММАК» ПРИ
АНАЛИЗЕ НА СОДЕРЖАНИЕ МИКОТОКСИНОВ

Экстракция
Подготовка проб для определения афлатоксина В1, зеараленона, дезоксиниваленола и Т-2 токсина
включает единую жидкостную экстракцию указанных соединений водным ацетонитрилом (16:84). Для
повышения эффективности ТФЭ водно-ацетонитрильный экстракт орехов и семян масличных культур, а
также растительного масла необходимо обезжиривать.

25 г измельченного образца экстрагируют 100 мл смеси ацетонитрил :


вода (84:16) в течение 30 минут встряхиванием на шуттель-аппарате.
Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр.
Фильтрат помещают и делительную воронку, где четырехкратно
обезжиривают гексаном по 50 мл каждый раз отбрасывая гексановый
слой .

25 мл 20 мл
Экстракта Экстракта
Афлатоксин В1 + ДОН + Т-2
зеараленон
Афлатоксин В1 и зеараленон

1. 25 мл экстракта – ПРОПУСТИТЬ
1

Диапак А-3
2. СОБРАТЬ 20 мл элюата

Диапак
+ 20 мл воды,
перемешать

1. Кондиционируют пропусканием
5 мл ацетонитрила и 5 мл воды.
П-
Диапак П-

2. 40 мл экстракта – ПРОПУСТИТЬ
Диапак

3. Промыть патрон 5 мл воды.


2
3

4. Элюировать афлатоксин и
зеараленон последовательно
7 мл ацетонитрила + 7 мл
бензол: ацетонтрил (1:2) + 7 мл
бензол: ацетонтрил (1:1).
Элюаты СОБРАТЬ !!!
5. Осушить элюаты 10 г безводного
сульфата натрия.
6. Упарить.
Афлатоксин В1 и зеараленон
В зависимости от типа проб можно
избрать один из результирующих этапов

1. Кондиционировать 5 мл 1. Кондиционировать 5 мл
бензола бензола
3

Диапак Н
2. Сухой остаток растворить в

Диапак С
2. Сухой остаток растворить в
0,5 мл бензола – НАНЕСТИ

Диапак
0,5 мл бензола – НАНЕСТИ
3. Отгонную колбу ополоснуть 3. Отгонную колбу ополоснуть
2х 0,5 мл бензола –НАНЕСТИ 2х 0,5 мл бензола –НАНЕСТИ
4. Элюаты ОТБРОСИТЬ ! 4. Элюаты ОТБРОСИТЬ !
5. Элюировать ЗЕАРАЛЕНОН 5. Элюировать ЗЕАРАЛЕНОН
9 мл бензол : этилацетат (9:1) 6 мл бензол :СН3СООН (49:1)
6. Промыть патрон 3 мл смеси 6. Элюировать Афлатоксин В1
бензол :СН3СООН (19:1)
5 мл бензол:ацетонитрил (8:2)
7. Промыть патрон 4 мл смеси
гексан :диэтиловый эфир (3:1)
8. Элюировать Афлатоксин В1
6мл дихлорметан:ацетон
(9:1)

Элюаты упарить при температуре не


более 40-50° С

ВЭЖХ или ТСХ


ДОН и ТОКСИН Т-2
1. 20 мл экстракта – ПРОПУСТИТЬ
2. Патрон промыть 5 мл смеси
1

Диапак АУ-
ацетонитрил:вода (84:16)
3. СОБРАТЬ ВСЕ ЭЛЮАТЫ !!!

Диапак
33
Упарить досуха при
Т= 60-70 °С, добавляя изо-
пропанол.

1. Кондиционировать 5 мл бензола
2. Сухой остаток растворить в 0,5 мл
Диапак Н
Диапак хлороформа – НАНЕСТИ
3. Элюат ОТБРОСИТЬ !
4. Отгонную колбу ополоснуть 2х 0,5
мл хлороформа –НАНЕСТИ
2
5. Элюаты СОБИРАТЬ !
6. Элюировать ТОКСИН Т-2 2 мл
хлороформа.
7. Элюировать ДОН 6 мл 20 %
Упарить при Т=40-45 °С ацетона в хлороформе.

ТСХ, ВЭЖХ,ГЖХ
ПАТУЛИН
1. Весь фильтрат – ПРОПУСТИТЬ
1. Соки просто фильтруют 20 мл. 2. Патрон промыть 10 мл воды –
1

Диапак П-3
2. Соки с мякотью 10 г смешивают с 6 ОТБРОСИТЬ.
мл р-ра Кареза I и р-ра КарезаII. 3. Элюировать 10 мл этилацетата в колбу
Доводят объем до 50 мл,

Диапак
с 5 мл 1,5 % карбоната натрия.
перемешивают и фильтруют. Перемешать, отделить этилацетат в
3. Патрон кондиционировать 5 мл колбу для упаривания. Водный раствор
ацетонитрила а затем 5 мл воды. экстрагировать еще 10 мл этилацетата.
Этилацетатные экстракты объединить,
сушить безводным сульфатом натрия.

Упарить до объема
0,5 мл при
Т= 40 °С, добавить
Диапак С
Диапак 2,5 мл бензола.

1. Кондиционировать 5 мл бензола
2
2. НАНЕСТИ предыдущий элюат. Смыть
колбу 0,5 – 1,0 мл 15% этилацетата в
бензоле и тоже нанести. Все смывы
отбросить.
3. Элюировать ПАТУЛИН 6 мл 30%
Упарить при Т=40 °С этилацетата в бензоле.

ТСХ, ВЭЖХ
 Quick: экстракция 8 образцов за 30 минут.
 Easy: нет необходимости применения дополнительных способов подготовки и
очистки, что уменьшает риск ошибки.
 Cheap: коммерческая доступность и приемлемая цена расходных материалов,
снижение трудовых затрат.
 Effective: высокая степень извлечения для широкого спектра пестицидов и
микотоксинов.
 Rugged: простота метода обеспечивает высокую надежность и
воспроизводимость.
 Safe: уменьшение количества применяемых органических растворителей .
Задействованное оборудование

Стандартная методология Метод QuEChERS


Состав порошка для модификации матрицы на первом этапе метода
EN AOAC
4 г ± 0.2 г Безводный сульфат магния 6 г ± 0.2 г Безводный сульфат магния
1 г ± 0.05 г Хлорид натрия 1,5 г ± 0.05 г Хлорид натрия
1 г ± 0.05 г Тринатрий цитрат дигидрат 1,5 г ± 0.05 г Ацетат натрия
0.5 г ± 0.03 г Динатрий гидроцитрат -
сексвигидрат
МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
МИКОТОКСИНОВ
 НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ МЕТОДОМ ТСХ

o Афлатоксин В1
Самым приемлемым вариантом, улучшающим идентификацию микотоксинов
из группы афлатоксинов является метод ТСХ, реализованый в методике,
разработанной CAMAG под шифром А-12.4Е «Determination of aflatoxins B1, B2,
G1, and G2 in foodstuffs». Предел определения афлатоксина В 1 в орехах по
данной технологии составляет 1 ppb (1 мкг/кг), что в принципе, достаточно для
гарантированной идентификации и оценки количества микотоксина, даже если
коэффициент рикавери составляет менее 60 % (хотя и метод декларирует от 70
до 100%).
«Изюминками» этой методологии являются применение ВЭТСХ пластин,
предхроматография в диэтиловом эфире, позволяющая отделить вещества
матрикса и удалить их, а также применение доступных стабилизаторов-
усилителей флуоресценции. При этом достигается высокая чувствительность
определения и практически полное отсутствие мешающих веществ. Применение
предхроматографирования позволяет избавиться от матричных
коэкстрактивных компонентов практически на самой пластинке, что очень
удобно. Фактически колоночную доочистку образцов можно не проводить.
Стандартный раствор афлатоксина В1, согласно метода, содержит 2 нг/мкл
токсина и применяются ВЭТСХ пластинки фирмы Merck 60F254.
Вещества
матрикса

St U U U St U U U St
90 мм St U U U St U U U St

1 Диэтиловый 3
2 эфир
St U U U St U U U St
50 мм

Отрезать

St U U U St U U U St 15 мм ТЭМ или
Хлороформ:
ацетон: вода
(140:20:0,3)
5 6
4
St U U U St U U U St St U U U St U U U St

Выбросить
* St – раствор стандартного образца по 5 мкл U - раствор образца по 100 мкл
Как вариант подтверждения наличия афлатоксина В1 и для увеличения
чувствительности предлагается проведение предхроматографической
дериватизации безводной ТФУ (трифторуксусной кислотой ) непосредственно
на пластинке в точке нанесения образцов капельным методом. Для этого в
точки с нанесенными испытуемыми образцами и стандартными растворами
после предхроматографирования в диэтиловом эфире наносят по 5 мкл ТФУ,
выдерживают 5 минут при комнатной температуре, а затем пластинку
подогревают до 35-40 °С в течение 2 минут. Далее хроматографируют как
обычно

Эта дериватизация существенно повышает квантовый выход флуоресценции


(т.е. производное афлатоксина В1 имеет более интенсивное свечение) и
неколько меняет Rf локализации пятна афлатоксина, что в некоторых особо
сложных случаях повышает надежность идентификации. Для стабилизации
флуоресценции и повышения чувствительности пластинку пропитывают
раствором вазелинового масла в гексане (2:3).
o Токсин Т-2 и дезоксиниваленол (ДОН )

Все, кто так или иначе выполнял анализы по определению ДОНа или Т-2
методом ТСХ, сталкивался с проблемой матричного фона, покрывающего зоны
расположения пятен этих двух токсинов. Проявление ДОНа 20% спиртовым
раствором хлорида алюминия приводит к возникновению голубой
флуоресценции практически всего хроматографического трека, всех
коэкстрактивных веществ, флавоноидов , что чрезвычай но ухудшает
детектируемость токсинов. Аналогичная ситуация возникает и с проявлением
зон локализации токсина Т-2.
В качестве альтернативы предлагается использование более гибкой системы
проявления - анисовый альдегид/серная кислота .
Приготовление раствора для опрыскивания :
0,5 мл анисового альдегида смешать с 8 мл концентрированной кислоты,
охладить и добавить смесь из 85 мл метанола и 10 мл ледяной уксусной
кислоты.
Приготовление раствора для смачивания :
1 мл анисового альдегида и 2 мл концентрированной серной кислоты
растворить в 100 мл ледяной уксусной кислоты.
После обработки этим реактивом и нагревания пластинки при 90-125 °С 1-15
минут пятна ДОН и Т-2 окрашиваются в коричневый цвет. При чем при
просмотре пластинки в УФ-365 нм, наблюдается интенсивная флуоресценция
без матричного эффекта.
Физико-химические свойства некоторых трихотеценовых микотоксинов, относящихся к А и В типам

Цвет после
Эмпирическая Молекулярная Точка плавления, Цвет после обработки
Микотоксины обработки Н2SО4
формула масса °С p-анисовым
альдегидом
Т-2 токсин С24Н34О9 466 150-151 Серое* Пурпурное*
НТ-2 токсин С22Н32О8 424   То же То же
Неосоланиол С19Н26О8 382 150-151 То же То же
Т-2 тетраол С15Н22О6 298   То же То же

Диацетоксискирпенол С19Н26О7 366 162-164 Пурпурное* То же

Моноацетоксискирпенол С17Н24О6 324 173 То же То же

Скирпентриол С15Н22О5 282 189-191 Коричневое Пурпурное


Ниваленол С15Н20О7 312 222-223 Коричневое То же
Фузаренон-Х С17Н22О8 354 91-92 То же Желтое

Диацетилниваленол С19Н24О9 396 135-136 Коричневое Пурпурное

Дезоксиниваленол С15Н20О6 296 131-135 Желтое Желтое

3-ацетилдезоксиниваленол С17Н22О7 338 185-186 То же То же


Интересным решением в области ТСХ токсинов трихотеценового ряда
является метод мицеллярной хроматографии (Д.В. Едаменко, Л.П. Логинова, А.И.
Пугач, О.В. Труфанов «Применение мицеллярных растворов поверхностно-
активных веществ в качестве элюентов при ТСХ-определении микотоксинов в
зерне») .
В качестве нетоксичной , лишенной прекурсоров подвижной фазы
предлагается водный раствор ПАВ (0,005 моль/л Твин-80 и 0,005 моль/л
цетилпиридиния хлорид ЦПХ рН=9.0).
o ЗЕАРАЛЕНОН

В методе ТСХ затруднено детектирование этого микотоксина в связи с тем,


что самоиндуцирующаяся флуоресценция у него чрезвычай но мала. Слабое
голубоватое свечение в местах локализации зераленона на ТСХ пластинках
позволяет детектировать его с весьма низкой чувствительностью. Проявление
диазокрасителями типа Синий прочный ВВ или Красный прочный ЖЖ тоже не
является специфичным и на фоне интенсивноокрашенного фона обладает
сравнительно низкой чувствительностью.
Проверенным и надежным методом специфичной визуализации зеараленона
на ТСХ пластинках является проявление раствором бисдиазотированного
бензидина. При этом зеараленон отчетливо и специфично проявляется через 10
минут в виде красно-коричневых пятен на бледно-желтом фоне.
Зеараленон в подсолнечном масле

Зеараленон в комбикормах
Рецепт приготовления проявителя описан в Россий ском ГОСТ Р 51425-99
«Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения массовой доли
зеараленона», который в свою очередь является переводом международного
стандарта ISO 6870-85.

Приготовление раствора бензидина (раствор А):


0,5 г бензидина растворить в смеси 20 мл дистиллированной воды и 1,5 мл
концентрированной соляной кислоты. После растворения всего бензидина
объем довести до 100 мл водой и перемешать.

Приготовление раствора нитрита натрия (раствор Б):


10 г нитрита натрия растворить в 50 мл воды. Довести до объема 100 мл
водой и перемешать.

Приготовление проявителя бис-диазотированного бензидина :


Смешивают охлажденные раствор А и раствор Б в равных количествах.
Сначала раствор становится мутным и имеет пурпурный цвет. После того как
температура раствора приблизится к комнатной он становится желтым. Раствор
готовят свежим на момент обработки ТСХ.

После обработки проявителем через 10-15 минут зеараленон проявляется в


виде красно-коричневых пятен .
 НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ МЕТОДОМ ВЭЖХ

o Афлатоксин В1 ОФ - ВЭЖХ
При определении афлатоксинов методом ВЭЖХ традиционно применяется
флуоресцентное детектирование, поскольку практически все афлатоксины
хорошо флуоресциируют при облучении раствора УФ светом с длиной волны
возбуждения 365 нм. Для повышения чувствительности детектирования в
некоторых методиках применяют дериватизацию афлатоксина В 1 чтобы
повысить квантовый выход флуоресценции, а соответственно понизить предел
обнаружения. Связано это бывает часто с применением ТФЭ (твердофазной
экстракции), которая позволяет извлекать лишь определенную часть
микотоксина, например, эквивалентную 10 г образца корма или продукта
вместо 25 или 50 грамм. Это позволяет не перегружать картридж для ТФЭ
коэкстрактивными веществами, но количество извлеченного микотоксина
часто находится на пределе детектирования. Добиться стабильного и надежного
детектирования можно либо увеличив количество наносимого экстракта на
картридж ТФЭ (что за собой влечет увеличение расхода реактивов и
применение картриджей большей емкости) , либо повысив квантовый выход
флуоресценции анализируемых веществ. Одним из решений является прием,
который применяют иногда в ТСХ. Это превращение афлатоксина В1 в
афлатоксин В2а, предколоночной обработкой безводной трифторуксусной
кислотой . Процесс дериватизации чрезвычай но прост. К высушенному образцу
подготовленному к ВЭЖХ анализу в остродонной колбе или виале добавляют
100 мкл безводной ТФУ, закрывают пробкой и подогревают в темноте при
40-45 °С 15 минут, затем высушивают продувкой азотом до удаления ТФУ. Далее
пробу растворяют в необходимом объеме подвижной фазы. Этот принцип
дериватизации положен в основу метода ВЭЖХ, разработанного фирмой Люмэкс
(МВИ М 04-32-2004) . Благодаря дериватизации чувствительность метода
составляет 0,07 мкг/кг.
Из-за заметного гашения флуоресценции в протонных растворителях
чувствительность прямого флуориметрического определения афлатоксинов В 1 и
G1 (в отличие от G2 и B2) оказывается неудовлетворительной (почему более
предпочтительной хроматографией является нормально-фазовая или
адсорбционная) . Для удовлетворительного определения афлатоксинов B 1 и G1 в
методике, разработанной компанией ЗАО«Аквилон», предложено использовать
предколоночную дериватизацию раствором й ода. Время, необходимое для
прохождения реакции дериватизации афлатоксинов B1 и G1, составляет 20 мин.
Для проведения анализа предварительно готовят рабочие растворы из СОП
афлатоксинов в ацетонитриле или из СОП афлатоксинов в бензоле (путем
перерастворения в ацетонитриле), далее готовят градуировочные растворы
путем подкисления рабочих растворов смесью дистиллированная вода – уксусная
кислота (1:1) и дериватизации раствором й ода (рабочий раствор – «кислая вода»
– 0,1 % раствор й ода (1:8:1, по объему)). Чувствительность -2,5 мкг/кг.
Компоненты:
1. Афлатокcин G2
2. Афлатокcин G1 (после дериватизации й одом J2)
3. Афлатокcин B2
4. Афлатокcин B1 (после дериватизации й одом J2)

Колонка: Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм


Защитная колонка: SecurityGuard C18 4х3.0 мм
Режим разделения: Изократический
Подвижная фаза: н-бутанол/ацетонитрил/вода/уксусная кислота (8:14:76:1)
Расход: 0.9 мл/мин
Температура колонки: 50°С
Объем пробы: 20 мкл
Детектор: Флуориметрический
Параметры детектирования: RFU 0.005, Ex-365нм, Em-400-460нм
Объект исследования: Зерно и продукты его переработки
Группы веществ: Микотоксины
Образец: проба муки с добавкой стандартной смеси афлатоксинов
В основной своей массе лаборатории, контролирующие содержание
афлатоксина В1 имеют в своем распоряжении УФ детекторы, как базовые и
предназначенные для проведения анализов по определению количества
пестицидов и других микотоксинов, отличных по свой ствам от афлатоксинов
(зеараленон, ДОН, Т-2, охратоксин А, патулин и т.д.). Зачастую бывает весьма
проблематично менять детектора, перестраивая хроматографические системы с
флюоресцентного детектора на УФ и обратно, тем более это не удобно при том
условии, что остальные микотоксины определяются исключительно с
использованием УФ детектирования (зеараленон – λ=274-280 нм, ДОН –λ= 210-
220 нм, патулин λ= 274 нм). Флуориметрический детектор безусловно имеет
преимущество перед УФ по чувствительности и по специфичности. Но при
применении ТФЭ (колоночной или дисперсионной ) или ИФА методик очистки
образцов УФ детекция является более удобным и универсальным методом. Так
чувствительность по афлатоксину В1 при детектировании λ= 360 нм не хуже - 2,5
мкг/кг и при этом растворенный кислород в протонных растворителях (вода,
ацетонитрил, метанол) не влияет на характеристики поглощения УФ света
афлатоксином.
Для подтверждения этого приведем коэффициенты молярной экстинции для
основных максимумов поглощения афлатоксина В1 в метаноле :
223 нм ¦22100
265 нм ¦12400
362 нм ¦21800
Применение линей ного градиента ацетонитрила от 10 % до 60 % за 25 минут и
многоволновой детекции позволяет определять помимо афлатоксина В1 (360
нм) и зеараленон (274 нм) и ДОН (220 нм).
o Афлатоксин В1 НФ - ВЭЖХ
Минздравом утверждена методика ВЭЖХ определения афлатоксина В 1
методом нормально-фазовой хроматографии за № 4082-86 . Её основным
недостатком является использование элюента, содержащего 95% диэтилового
эфира. Учитывая, что температура кипения эфира 34 ° С, а температура
кюветного отделения большинства хроматографов 33 − 36 °С, становится
очевидно, что стандартные детекторы полностью неработоспособны при
использовании указанного элюента. Таким образом, для использования
нормально-фазового варианта методики определения афлатоксина В1 был
разработан элюент, пригодный для применения в условиях НФ.
Условия хроматографического анализа: подвижная фаза «хлороформ-
гексан-метанол-уксусная кислота» в объёмном соотношении 70:30:1:1,
детектирование на длине волны 358 нм, скорость подачи подвижной фазы −
150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 20 мкл (в смеси бензол – ацетонитрил
98:2) для хроматографов типа «Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант». Для
хроматографического анализа применяются колонки 100× 2 или 120х2,
заполненные адсорбентом Силасорб-600 (5 мкм).
Требования к проведению хроматографического анализа

1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является


использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и
градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при
кондиционировании хроматографической колонки.
2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз)
элюированием градуировочного раствора В1. Критерием завершения
кондиционирования является воспроизводимость времён удерживания
исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём составляет порядка
800 мкл (5-6 минут при скорости подачи 150 мкл/мин) для хроматографов типа
«Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант».
3. Удерживаемый объем афлатоксина В1 можно легко оптимизировать,
изменяя объёмное содержание хлороформа в элюенте.

Подготовка пробы

1. Подготовка пробы проводится по стандартной методике .


2. Сухой остаток перерастворяется в смеси «бензол-ацетонитрил» в
соотношении 98:2.
3. При анализе зерна и зернопродуктов, а иногда и других продуктов
растительногопроисхождения очистку экстракта колоночной
хроматографией на силикагеле можно не проводить.
4. При потоковом анализе однотипных образцов желательно предварительно
определить степень извлечения афлатоксина, которая может отличаться от
100%.
Рис. Хроматограмма экстракта арахиса.
1 – афлатоксин В1, в пике 5 нг.

В указанных условиях достигается оптимальный результат, сочетающий


максимальную высоту пика афлатоксина В1 с его хорошим разделением от
пиков примесей , присутствующих в пробе. Предел определения на длине
волны 358 нм составляет 2.5 нг вещества в пике, что соответствует (при
массе навески 25 г и объему вводимой пробы 20 мкл) содержанию афлатоксина
В1 2.5 мкг/кг, или 0.5 ПДК.
o Зеараленон ОФ-ВЭЖХ

Применение линей ного градиента


ацетонитрила от 10 % до 60 % за 25
минут и многоволновой детекции
позволяет определять помимо
афлатоксина В1 (360 нм) и
зеараленон (274 нм).
Компанией ЗАО «Аквилон» разработана ВЭЖХ методика №32-08 от 04.03.2008,
обеспечивающая чувствительность по зеараленону на уровне 0,1 мг/кг.
Условия:
•изократический режим;
•колонка: Synergi Hydro-RP 4 мкм 250х4,6 мм или Synergi Hydro-RP 4 мкм
250x3,0 мм (Phenomenex, США);
•защитная колонка: С18 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
•подвижная фаза: смесь ацетонитрил – вода – концентрированная
ортофосфорная кислота (60:40:1);
•скорость потока: 0,9 мл/мин (или 0,4 мл/мин при использовании колонок
Synergi Hydro-RP 250х3,0 мм);
• объем петли: 20 мкл;
• температура: 50°С;
• детектирование: спектрофотометрическое, длина волны 280 нм.

Зеараленон в пробе хлеба Стандартный раствор зеараленона


o Зеараленон НФ-ВЭЖХ
Минздравом утверждена методика ВЭЖХ определения зеараленона методом
нормально-фазовой хроматографии за № 5177-90 . Её основным недостатком
как и в случае НФ ВЭЖХ афлатоксина В1 является использование элюента,
содержащего 50% диэтилового эфира. Таким образом, для использования
нормально-фазового варианта методики определения зеараленона был
разработан элюент, пригодный для применения в условиях НФ.
Условия хроматографического анализа: подвижная фаза «гексан –
хлороформ – иизопропиловый спирт – уксусная кислота» 65:25:1.5:1,
детектирование на длине волны 282 нм, скорость подачи подвижной фазы −
150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 5 мкл для хроматографов типа
«Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант». Для хроматографического анализа
применяются колонки 100× 2 или 120х2, заполненные адсорбентом Силасорб-
600 (5 мкм).

Требования к проведению хроматографического анализа

1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является


использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и
градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при
кондиционировании хроматографической колонки.
2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз)
элюированием градуировочного раствора зеараленона. Критерием
завершения кондиционирования является воспроизводимость времен
удерживания исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём
составляет порядка 1500 мкл (9-10 минут при скорости подачи 150
мкл/мин). для хроматографов типа «Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант».

Подготовка пробы

3. Подготовка пробы проводится по стандартной методике .


4. Сухой остаток перерастворяется в смеси «бензол-ацетонитрил» в
соотношении 98:2.
3. При потоковом анализе однотипных образцов желательно предварительно
определить степень извлечения зеараленона, которая может отличаться от
100%.
Рис. Хроматограмма экстракта пшеницы:
1 – зеараленон.

При использовании кондиционированной колонки, время выхода


хроматографа на рабочий режим не превышает 30 мин. Предел
детектирования при использовании УФ-детектора на длине волны 282 нм
составляет 0.1 мг/кг.
o Токсин Т-2

Вот с токсином Т-2 и вообще со всеми трихотеценовыми микотоксинами


возникают самые большие проблемы с надежной идентификацией и
выполнением анализов. Для токсина Т-2 имеется два официальных метода - ТСХ
с проявлением сернокислотным проявителем и ГЖХ с детектированием
трифторацетильных производных токсина Т-2. В утвержденной методике №3184-
84 вообще допущена методическая ошибка, которая не позволяет получать эти
самые ТФА-производные по очень простой причине, - в нативном токсине Т-2
отсутствуют группы, способные взаимодей ствовать с трифторуксусным
ангидридом. Один-единственный гидроксил находится в пространственной
недоступности для данного реагента. Поэтому имеется методика, которая
корректирует упомянутый выше недостаток путем приедварительного
гидролиза токсина Т-2 до Т-2-тетраола у которого имеется четыре гидроксильных
группы, способных взаимодей ствовать с трифторацетангидридом или
гептафтормаслянным ангидридом.
Омыление пробы
К пробе добавляют 1 мл 4%-ного раствора едкого натра в 30% - ном
изопропиловом спирте. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной
температуре.
Экстракция продуктов омыления
Щелочь ней трализуют добавлением 2 %-ного раствора уксусной
кислоты (около 2 мл ) до pH среды 5 - 7 (контроль по универсальной
индикаторной бумаге). Смесь помещают в делительную воронку или в
пробирку вместимостью 10 мл, добавляют 3,5 мл смеси ацетонитрил - бензол
(3:0,5), на кончике шпателя - сульфат аммония, встряхивают и отделяют в
чистую сухую колбу верхний ацетонитрильный слой (при использовании
пробирки экстракт отделяют с помощью пипетки). Экстракцию
повторяют дважды. Объединенные экстракты высушивают добавлением 1
г безводного сульфата натрия, фильтруют через ватный тампон в
грушевидную колбу, куда предварительно помещают около 200 мг
силикагеля для колоночной хроматографии, и упаривают досуха на
ротационном испарителе при температуре 40 - 45 °С (до получения
сыпучего силикагеля).
Очистка продуктов омыления
Очистку продуктов омыления проводят с помощью колоночной
хроматографии. Для хроматографии используют растворители, очищенные
путем дистилляции. Безводный сернокислый натрий и силикагель
промывают последовательно бензолом и ацетоном, затем высушивают на
воздухе и прокаливают в сушильном шкафу при 100 °С в течение часа. На
дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, 3 – 5 мл бензола, безводный
сульфат натрия (толщина слоя 5 мм, очищенный , как указано выше), заливают
суспензию 2 г (3,6 мл) силикагеля в бензоле, не давая бензолу стечь (колонка
закрыта снизу), высыпают омыленную пробу на силикагеле и после оседания
твердых частиц насыпают безводного сульфата натрия (10 мм). Дают бензолу
стечь и колонку промывают последовательно 25 мл смеси бензол - ацетон
(95:5) (элюат отбрасывают) и 70 мл смеси бензол - ацетон (1:1). Элюат
собирают в круглодонную колбу, упаривают на ротационном испарителе до
объема 1 мл. Остаток переносят в виалу (емкость вместимостью 4 – 6 мл с
герметично завинчивающей ся крышкой ) или в пробирку вместимостью 5 мл с
НШ 14,5, упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,02 мл бензола,
очищенного дистилляцией над металлическим натрием (раствор А).
периодическом встряхивании. Содержимое пробирки разбавляют бензолом
до 1 мл и фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в другую
пробирку вместимостью 5 мл с НШ 14,5. Углекислый натрий на фильтре
промывают 0,5 мл бензола. Объединенные бензольные фильтраты упаривают
досуха в токе азота (при отсутствии баллона с азотом можно упарить досуха
на ротационном испарителе). Остаток растворяют в 0,02 мл бензола и
анализируют с помощью ГЖХ.

НО !!!
Метод ГЖХ достаточно трудоемок и приведенные корректировки этого метода
стоит использовать в тех лабораториях, в которых используется данный
стандартный метод определения токсина Т-2.
Имеющиеся свободные гидроксилы у трихотеценовых микотоксинов обеих
групп А и Б могут быть модифицированы гораздо более эффективно и менее
трудоемко путем получения силильных производных. Например издательство
«ELSEVIER» в микрохимическом журнале опубликовало статью о методе
силирования трихотеценовых микотоксинов N,N-диметил-триметилсилил
карбаматом. Технология получения силильных производных достаточно легко
исполнима и не содержит сложностей .
Z.Eke, A.Kende, K.Torkos «Simultaneous detection of A and B trichothecenes by gas
chromatography with flame ionization or mass selective detection».
ЭКСТРАКЦИЯ
2,5 г
4 мл фильтрата
пробы 1. + 10 мл смеси ацетонитрил : вода
(84:16)
2. Встряхивать 30 минут
3. Фильтровать

15 мл CLEAN-UP картридж , содержащий (сверху-

СCLEAN-UP
вниз) сульфат аммония – целит (HM-N)-оксид
алюминия ней тральный – активированный уголь
(основный ) - С18 (ЕС)
Инжектор ______________________________________________________________

FID 250°С
1. Промыть 8 мл ацетонитрила, затем 8 мл смеси
1μL ацетонитрил : вода (84:16) – ОТБРОСИТЬ.
260°C 2. Нанести 4 мл фильтрата и дать впитаться.
3. Элюировать токсин Т-2 8 мл смеси
ацетонитрил:вода (84:16). – СОБРАТЬ !!!

Элюат упарить насухо при температуре 75 °С


под вакуумом или в токе инертного газа

Колонка CP- SIL 8CB, 30 m


Добавить 0,075 мл н-гексана, содержащие
0.32 mm I.D., 0 .25 μm
Т =140°С – 1 мин
Затем нагрев до Т = 250 °С со
+ внутренний стандарт н-докозан (13,16
мкг/мл) и 0,075 мл N,N-диметил-трисилил
карбамата. Реакционную смесь перемешать
скоростью 6 °С/мин , при встряхиванием и оставить на 50 минут для
достижении температуры дериватизации.
выдержка 5 минут
 Используется только один тип растворителя (ацетонитрил / вода смесь
84:16) от экстракции и до конечной очистки образца.
Вся очистка состоит из одного шага без промывки и дополнительных
шагов по дериватизации.
Дериватизация происходит при комнатной температуре.
Побочные продукты дериватизации не мешают хроматографированию
из-за своей нестабильности.
Избыток реагента удаляется до инжектирования.
Подготовка образца проста и не требует специальных приемов.
Не используются хлорированные растворители.
Оба типа трихотеценовых микотоксинов анализируются одновременно.
Простая пробоподготовка экономит время (на все этапы, включая
дериватизацию необходимо не более 4 часов) и не требует специальной
подготовки.
Для хроматографирования используется стандартное оборудование.
ВЭЖХ методик определения трихотеценовых микотоксинов за исключением
ДОНа фактически нет. Да и с ДОНом не все так благополучно, поскольку ни
один трихотецен не обладает флуоресценцией и не поглощает УФ свет в
дальнем диапазоне. ДОН худо-бедно детектируют при длине волны УФ света
λ=210-220 нм, а токсин Т-2 вообще не поглощает УФ свет.
Издательство «ELSEVIER» в Jornal of Chromatographia опубликовало статью о
методе дериватизации трихотеценовых микотоксинов обеих групп
флуресцентным реагентом кумарин-3-карбонил хлоридом. В результате
реакции образуются флуоресцентные производные, которые хорошо
детектируются как флуоресцентным детектором, так и УФ.
Кумарин-3-карбонил хлорид можно приобрести как готовый реагент, так и
легко синтезировать самостоятельно из простых реагентов, тем более, что
синтез одностадий ный .
Авторы гарантируют диапазон линей ности от 100 до 2500 нг/г содержания
трихотеценов в пробах. Разработанный метод хорошо себя зарекоммендовал
при анализе тестовых материалов, зараженных микотоксинами, обеспечивая
высокую точность определения и коэффициент определения не менее 89 %
для ДОНа при применении имуноафинных колонок Mycosep 225 при
пробоподготовке.
ЭКСТРАКЦИЯ
25 г
Фильтрат
пробы 1. + 100 мл смеси ацетонитрил : вода
(80:20)
2. Гомогенизируют в блендере
5 минут
3. Фильтруют

НАСОС

Mycosep 225
0–10 min, MeOH–H2O
(60:40); 10–40 min, 1. Промыть 8 мл ацетонитрила, затем 8 мл смеси
линей но до MeOH– ацетонитрил : вода (80:20) – ОТБРОСИТЬ.
H2O (80:20); 40–50 2. Нанести фильтрат.
min, MeOH–H2O Инжектор 3. Собрать первые 8 мл элюата !!!
(60:40)-регенерация 25μL
Скорость: 0,2
мл/мин

Отобрать 4 мл элюата и упарить насухо при


Spherisorb

температуре 75 °С в токе инертного газа в


Spherisorb S3ODS2

FLD – ДЕТЕКТОР
виале. Сухой остаток растворить в 0,1 мл
λex = 292 nm and λem = 425 nm ацетонитрила.
S3ODS2 (250
(250 mm

Добавить 85 мкл раствора


mm ×× 2.1

диметиламинопиридина в ацетонитриле 10
мг/мл и 150 мкл раствора кумарин-3-
2.1 mm,

карбонилхлорида в ацетонитриле 10 мг/мл и


+
mm, 33 μm)

165 мкл ацетонитрила. Реакционную смесь


перемешать встряхиванием и оставить на 60
μm)

минут для дериватизации в термошкафу при


80 °С. После дериватизации пробу охладить и
упарить насухо. Остаток растворить в 1 мл
метанола.
o ДОН НФ - ВЭЖХ

Минздравом утверждена методика ВЭЖХ определения


дезоксиниваленола методом нормально-фазовой хроматографии за № 5177-
90 . Основным недостатком утвержденной методики является слишком
высокое содержание изопропилового спирта и воды в элюенте состава
«гексан-изопропанол-вода» в соотношении 85:25:1.5 по объему . Такое
содержание изопропанола связано с использованием аналитических
колонок 250×4. В результате хроматографический пик дезоксиниваленола
при использовании колонок 100 × 2 (для хроматографов типа «Милихром-
4,5,6, А-02» или «Орлант») оказывается на «хвосте» выходящих в начале
хроматограммы компонентов, мешающих определению. В результате
адаптации методики для колонок 100× 2 предложен для применения
элюент «гексан-изопропанол-вода» в соотношении 85:22:1 (по объему).
Такое, казалось бы, незначительное изменение состава элюента приводит к
резкому улучшению разрешения.
Условия хроматографического анализа: подвижная фаза гексан-
изопропанол-вода в соотношении 85:22:1, детектирование на длине волны
224 нм, скорость подачи подвижной фазы − 150 мкл/мин (для хроматографов
типа «Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант»), объём вводимой пробы − 5 мкл.
Для хроматографического анализа применяются колонки 100× 2 или 120х2,
заполненные адсорбентом Силасорб-600 (5 мкм).
Требования к проведению хроматографического анализа

1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является


использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и
градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при
проведении кондиционирования хроматографической колонки.

2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз)


элюированием градуировочного раствора ДОН. Критерием завершения
кондиционирования является воспроизводимость времён удерживания
исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём составляет
порядка 1500 мкл (9-10 минут при скорости подачи 150 мкл/мин).

Подготовка пробы

1. Подготовка пробы проводится по стандартной методике.


2. Сухой остаток перерастворяется в смеси бензол-ацетонитрил 98:2.
3. Очистку экстракта на активированном угле и окиси алюминия можно не
проводить. В этом случае от общего экстракта для анализа на ДОН берётся
аликвота не 25 мл, а 50 мл.
Примечания к методике

1. Как правило, пик дезоксиниваленола выходит в окружении двух пиков


близких по строению производных; спектральные отношения у этих трёх
пиков также близки. Для уверенной идентификации ДОН следует хотя
бы один раз проанализировать смесь пробы с градуировочным
раствором; в этом случае пик ДОН станет выше относительно других пиков
по сравнению с хроматограммой чистой пробы.
2. Для улучшения разделения ДОН и двух производных целесообразно
использовать колонки, имеющие эффективность не менее 8000 тт.
3. Предел детектирования при использовании УФ-детектора на длине волны
224 нм составляет 0.1 мг/кг.

Рис. Хроматограмма экстракта пшеницы.


1 – дезоксиниваленол.
o Патулин ОФ - ВЭЖХ

Главной проблемой при анализе патулина в яблочных продуктах (соки,


начинка сдобы и т.д.) является высокое содержание 5-гидроксометил-
фурфурола (ГМФ) - соединения, которое элюируется подобно патулину,
а также поглощает свет в УФ-диапазоне.
ГОСТ Р 51435-99 предлагает использование метода ОФ-ВЭЖХ для
определения патулина в фруктовых соках. Однако надежность этого метода
напрямую зависит от качества и эффективности применяемых
хроматографических колонок.
ООО «Люмекс» предлагает некоторые доработки официального метода,
которые гарантируют разделение ГМФ и патулина.
Диапазон измеряемых массовых концентраций патулина составляет 0,01–1,0
мг/л при объеме пробы готового к употреблению сока – 5 мл.
«Изюминкой » данной методологии является уменьшение доли ацетонитрила
по сравнению с методикой ГОСТ с 10% до 6 %.
o Патулин НФ - ВЭЖХ

При анализе патулина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ многие


лаборатории сталкиваются и с трудностями хроматографического характера:
пик патулина перекрывается с пиками веществ матрицы; эта проблема как
правило встает при анализе любых образцов, кроме яблочного сока.
Учитывая то, что селективность разделения в режиме ОФ ВЭЖХ изменить
путем варьирования состава элюента практически невозможно, метод
обращенно-фазовой хроматографии едва ли подходит для анализа патулина.
Для проведения подобного анализа может применяться и метод нормально-
фазовой хроматографии, который является более гибким методом; в этом
случае селективность разделения может быть отрегулирована путем
изменения состава подвижной фазы.
Анализ проводился на аналитической колонке 250× 4.6 мм с силикагелем
Силасорб 600 (для хроматографов типа «Милихром-4,5,6, А-02» или «Орлант»).
Для проведения анализа рекомендуется применять хроматографическую
предколонку. Для элюирования применялись подвижные фазы гексан-
этилацетат-уксусная кислота 70:45:1.5 об.% (элюент 1) и гексан-этилацетат-
уксусная кислота 70:35:1.5 об.% (элюент 2) при скорости подачи 1 мл/мин.
Детекция осуществлялась по УФ поглощению длине волны 273 нм.
Применение многоволновой детекции способно значительно увеличить
надежность проведения анализа.
Рис. Хроматограммы

a) образца апельсинового сока


с добавкой патулина на уровне
100 мкг/кг (2 ПДК);

б) образца апельсинового сока


без добавки патулина. Элюент 1.
1 – патулин, 2 – ОМФ.
Рис. Хроматограммы образца концентрата яблочного сока с натуральным
загрязнением патулином (11.6 мкг/кг).
a) исходный образец;
б) образец с добавленным для идентификации патулином. Элюент 2.
1 – патулин, 2 – ОМФ.
o Охратоксин А ОФ - ВЭЖХ
На Украине переведены две ISO методики определения охратоксина А :
1.Продукти харчові. Визначання охратоксину А в зерні та продуктах із
зернових культур. Частина 1. Метод високоефективної рідинної хроматографії з
очищанням силікагелем (EN ІSO 15141-1:1998, ІDT)
2.Продукти харчові. Визначання охратоксину А в зерні та продуктах із
зернових культур. Частина 2. Метод високоефективної рідинної хроматографії з
очищанням бікарбонатом (EN ІSO 15141-2:1998, ІDT)
Компанией ЗАО «Аквилон» разработана ВЭЖХ методика №42-09 от
21.08.2009, обеспечивающая чувствительность по охратоксину А на уровне
0,0005 мг/кг.
Условия:
· изократический режим;
· колонка: «Synergi Hydro-RP» 4 мкм 250х4,6 мм (Phenomenex, США);
· защитная колонка: «С18 Aq» или «С18» 4x3,0 мм (Phenomenex, США);
· подвижная фаза: раствор аммония хлористого молярной концентрации 20
ммоль/дм3, pH 9,6–9,8 – ацетонитрил (81,5:18,5);
· скорость потока: 0,75 см3/мин;
· объем петлевого дозатора: 20 мкл;
· температура: комнатная;
· детектирование: флуориметрическое, λex 365±2 нм, λem 405-600 нм.
Колонка: Synergi Hydro-RP 250х4.6 мм 4 мкм
Защитная колонка: SecurityGuard C18 Aq 4x3.0 мм 
Режим разделения: Изократический
Подвижная фаза: р-р аммония хлористого 20
ммоль/дм3, pH 9,6–9,8 – ацетонитрил (81,5:18,5)
Расход: 0,75 см3/мин
Температура колонки: комнатная
Объем пробы: 20 мкл
Детектор: Флуориметрический
Параметры детектирования: λex (365±2) нм; λem
(405-600) нм
Объект исследования: Зерно и продукты его
переработки
Группы веществ: Микотоксины
Образец: Проба зерна с добавкой охратоксина А 1
ПДК

Компоненты:
1. Охратоксин А 
Удобной и воспроизводимой методикой является методика , разработанная в
России с применением имуноафинной очистки ( МУК 4.1.2204—07
«Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина А в
продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии»).
Метод включает следующие этапы:
• экстракция охратоксина А из пробы смесью ацетонитрил-вода (60 : 40 %
об.);
• очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;
• определение охратоксина А с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим
детектированием при длине волны возбуждения (λех) 333 нм и длине волны
эмиссии (λem.) 466 нм.
Диапазон определяемых концентраций : 0,001—0,016 мг/кг. Предел
количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Отобранные пробы измельчают в течение 1—2 мин в лабораторной


мельнице. При этом используют две параллельные пробы.
Экстракция
Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую
колбу на 250 см3, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60 : 40 % об.).
Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин.
Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя
лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см3 фосфатного буферного
раствора, рН = 7,4.
Очистка экстракта
На иммуноаффинную колонку Ochiaprep (R-Biophann, Великобритания)
наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1—2 капли в секунду,
промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А
элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98 : 2 % об.). Элюат упаривают
досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).
Условия хроматографирования
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60 : 40 % об.; рН = 3,0);
скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин. Флуориметрический детектор
устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии
эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.
Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью
микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика,
совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу
охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.
 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКОТОКСИНОВ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ
МЕТОДОМ

На практике для исследования кормов и продуктов питания в полевых


условиях, условиях производственных и испытательных лабораторий
требуются методы, позволяющие количественно и быстро исследовать
большое число образцов на наличие микотоксинов, по возможности с
наименьшими затратами сил и финансовых средств. Всем этим
характеристикам отвечают методы на основе иммунологических реакций .
Коммерчески доступные иммунологические методы для анализа микотоксинов
базируются на применении специфических моноклональных и
поликлональных антител против определенных токсинов, и в целом делятся
на:

•метод на основе иммуноафинных колонок (ИАК, IAC);


•иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) .
 
Обычно, иммуноафинные колонки фактически используются для очистки
образца от матричных соединений и позволяют провести выделение и
концентрирование определенного микотоксина. Следующая за этим элюция
токсина из ИАК позволяет провести количественное определение с
использованием классических аналитических методов. В случае проведения
иммуноферментного анализа, процедуры очистки обычно не столь
интенсивны как при других аналитических методах. Гомогенат или экстракт
образца, содержащий микотоксин, или непосредственно исследуется
количественно, используя стандартный микротитровальный планшет или
пробирочный анализ формата ИФА, или используется иммуноферментный
мембранный тест для проведения качественного или полуколичественного
определения наличия микотоксинов.  Иммуноафинные колонки обычно
используются для очистки исследуемого образца от сложных матриц и
концентрации токсинов перед обнаружением и оценкой содержания
микотоксина, используя ряд классических аналитических методов, таких как
ВЭЖХ, газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуорометрия, ВЭТСХ и
ТСХ. Метод заключается во введении экстракта образца в колонку,
содержащую иммуноафинную матрицу, содержащую твердую фазу (например,
гранулы агарозы), к которой ковалентно присоединены антитела против
микотоксина. Молекула токсина, содержащаяся в образце, присоединяется к
соответствующему иммобилизированному антителу.
Последующие шаги включают удаление несвязанных матричных
компонентов и экстрагента, элюцию токсина, изменяя элюирующий состав и,
наконец, обнаружение токсина, используя аналитические методы. Как
альтернатива, микотоксин, связанный в колонке, может быть элюирован и
непосредственно измерен флюорометрией , основанной на собственной
флюоресценции микотоксинов.
Мембранный тест позволяет за короткий период времени (около 10-15 мин)
дать ответ на вопрос: присутствуют ли в испытуемом образце микотоксины
выше уровня предела чувствительности данного теста? То есть фактически это
качественное определение наличия/отсутствия микотоксинов в пробе. Метод
требует экстракции, фильтрации, очистки (через колонку) и разведения
образца. Далее раствор наносится на мембрану сенсибилизированную
моноклональными антителами, куда также добавляется ферментный конъюгат
микотоксина. Если концентрация микотоксинов в образце превышает предел
чувствительности теста, все антитела на поверхности связываются с ними и
весь добавленный конъюгат удаляется на этапе отмывки. При добавлении
бесцветного субстрата конъюгат на поверхности мембраны катализирует
цветную реакцию, в результате которой на месте связывания конъюгата
образуется цветное пятно. Окрашивание аналитической зоны мембраны
говорит об отсутствии микотоксинов в образце.
Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия
микотоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом
образце.
В настоящее время доступен ряд качественных, полуколичественных и
количественных методов. Основываясь на результатах ИФА подозрительные
образцы должны быть перепроверены классическими методами. Доступны
различные варианты ИФА для анализа микотоксинов (например, мембранные
тесты, микротитровальные планшеты и пробирочные методы). Как правило,
метод ИФА основан на конкурентом анализе, который использует или
связанные с ферментным конъюгатом микотоксины, или антитела против
определенного анализируемого токсина . Типичная последовательность
реакций , используя готовые реактивы в формате микротитровального
планшета следующие:
 
1.     ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;
2.  смесь добавляется к соответствующим антителам, нанесенным на
поверхность лунок планшета (например, микротитровальный планшет,
сенсибилизированный антителами);
3. количество соединенного с токсином конъюгата, связываемое
иммобилизированными антителами зависит от количества токсина в образце;
чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество
ферментного конъюгата присоединившегося к антителам, нанесенным на
поверхность лунок планшета и наоборот;
4. ферментативная активность связанного с поверхностными антителами
конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что
приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых
обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце. 
Для наглядности рассмотрим вариант гетерогенного конкурентного ИФА,
реализованный в тест-системе RIDASCREEN FAST Афлатоксин М1. На рисунке 1
схематично показана лунка полистиролового планшета, в которой
последовательно выполняются все стадии иммуноферментного анализа.
Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован "антителами
захвата", наработанными к антителам к афлатоксину М1 (антигену)
Анализ выполняется следующим образом. :

1. Исследуемые или стандартные растворы, препарат, содержащий антитела к


афлатоксину М1 и препарат, содержащий коньюгат афлатоксина М1 с
ферментом, дозируются в лунки планшета (см. Рисунок 2). При инкубации
планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксина М1 и
молекулы коньюгата, конкурируя между собой , связываются антителами в
объеме раствора. В то же самое время, при инкубации происходит
иммуносорбция антител к определяемому антигену "антителами захвата" на
поверхности лунок планшета (см. Рисунок 3).
2. На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные
молекулы коньюгата (см. Рисунок 4).
3. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий
субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодей ствии
субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы
коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные продукты реакции (см. Рисунок 5).
4. После определенного времени развития данной цветной реакции, в
результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется
стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый (см. Рисунок
6)

Интенсивность окраски в лунках ИФА-планшета обратно пропорциональна


концентрации афлатоксина М1, другими словами - чем насыщенней цвет
растворов, тем меньше концентрация афлатоксина М1 в молоке.
Для исследования рекомендуется применять готовые тест-системы
производства компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией выпускается
ряд наборов для количественного определения микотоксинов: афлатоксины
В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, фумонизин
В1, цитринина. Следует отметить, что практически для всех перечисленных
микотоксинов существуют варианты тест-систем для определения особо
малых концентраций этих токсичных соединений с пределом
чувствительности на уровне хроматографических методик (RIDASCREEN®
Mycotoxins) (время инкубации 1-2 часа) и экспресс-методы, позволяющие
определять практически такие же концентрации в течение 15-30 минут
(RIDASCREEN® FAST Mycotoxins).
Организация анализа микотоксинов в кормах и пищевых продуктах
иммуноферментным методом возможна минимальными средствами и в самые
короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость
необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от
классических методов анализа и делают его особенно привлекательным для
лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями. Необходимо
отметить, что при практически равных показателях пределов обнаружения
методы иммуноферментного анализа являются более производительными и
позволяют проводить избирательное исследование только подозрительных
по ИФА образцов инструментальными методами.
Например, методом ИФА один лаборант может провести исследование 10-100
образцов за одну рабочую смену, в то время как при использовании ВЭЖХ –
только 1-10 проб. При этом на проведение иммуноферментного анализа
затрачивается от 15 минут до 3 часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом
ВЭЖХ – 2-4 часа при 1-3-дневной пробоподготовке.