Вы находитесь на странице: 1из 18

Кафедра Биохимии и технологии микробиологических производств

Конструирование продуцентов генно-инженерного


соматотропина

Выполнил: студент гр. МТБ01-19-01 С. А. Шакирова

Уфа 2020
Генная инженерия

Генетическая инженерия -
получение новых комбинаций
генетического материала путем
проводимых вне клетки
манипуляций с молекулами
нуклеиновых кислот и
переноса созданных
конструкций генов в живой
организм, в результате
которого достигается их
включение и активность в этом
организме и у его потомства.
Гормон роста человека (ГРЧ)

Соматотропин - гормон,
секретируемый передней
долей гипофиза.
Он стимулирует синтез
белка в органах и тканях и
рост молодого организма.

По своей структуре
является полипептидом,
состоящим из 191
аминокислотного остатка и
имеющим два
дисульфидных мостика.
Дефицит этого гормона приводит к
гипофизарной карликовости, частота
встречаемости которой оценивается
как 10 случаев на 1 млн. человек (среди
детей западных стран она составляет 1
на 5000 человек).

Карликовость, нормальный
рост, гигантизм
Гипофизарный нанизм- орфанное
заболевание
ИСТОРИЯ
Самый первый ГР был получен из трупа (а точнее экстракта гипофиза) и был
назван трупный препарат ГР. Из одного гипофиза (трупного) можно получить
всего 1 мг вещества, что составляет суточную норму для среднестатистического
человека.

Впервые соматропин из экстракта


гипофиза был протестирован в 1958 году,
затем вышел в свободную продажу и
только к 1985 году был запрещён.
Поводом для запрета явилось
возникновение от препарата побочных
эффектов – неизлечимой
болезни Крейтцфельдта-Якоба, которая
может быть передана от человека к
человеку только через кровь или
пересадку заражённых органов. Болезнь
К-Я имеет очень длительный
инкубационный период.
Фирма Genentech Inc.(CШA) в 1980 году
сконструировал "квазисинтетический" ген соматотропина
Рекомбинантный соматотропин,
получивший название СОМАТРЕМ, стал
вторым биосинтетическим
фармацевтическим препаратом.

Гормон обладает
биологической
активностью нативного
гормона и даже
большим эффектом, чем
гормон роста,
выделенный из
гипофиза.
КОНСТРУИРОВАНИЕ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК
На первом этапе клонируют
двунитевую ДНК- копию мРНК и
расщеплением рестрикционными 2
эндонуклеазами получают 3
последовательность, которая
кодирует всю аминокислотную
последовательность гормона, за 23
исключением первых 23 24
аминокислот. Затем химическим
методом синтезируют
полипептид, соответствующий 2
аминокислотам от 1-й до 23-й. 3
Далее два фрагмента
объединяют, «подстраивают» к
паре промоторов и участку
связывания рибосом
соматотропина. Рекомбинантная
ДНК вводится в клетку хозяина-
кишечную палочку.
Стадии биосинтеза соматотропина

 На 1 стадии конструируют рекомбинантную ДНК


 На 2 стадии рекомбинантную ДНК соматотропина вводят в клетку
кишечной палочку;
 На 3 стадии в биореакторе проводят культивирование
трансформированных клеток Е. Cоli в аэробных условиях;
 На 4 стадии проводят отделение биомассы кишечной полочки от
культуральной жидкости;
 На 5 стадии проводится выделение соматотропина из клеток
кишечной палочки путем их разрушения химическим способом
(раствор натрия гидрокарбоната, рН 11);
 На 6 стадии проводится очистка соматотропина от бактериальных
белков с помощью моноклональных антител.
ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ

Весь технологический цикл производства


рекомбинатного соматотропина состоит из 5
стадий:
1)конструирование рекомбинантной ДНК,
получение трансформированной клетки
микроорганизма;
2) ферментация
3) выделение и очистка:
- первичная очистка белка;
- хроматографическая очистка;
4) изготовление лекарственной формы;
5)анализ качества субстанции и лекарственной
формы соматотропина.
ФЕРМЕНТАЦИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

 Ферментация проводится
в биореакторах
глубинным
культивированием в
аэробных условиях на
традиционных для
микроорганизмов
питательных средах.
 Разрушение клетки
проводится химическим
методом: раствором
натрия гидрокарбоната c
pH=11 (на 98 %).
ПЕРВИЧНАЯ ОЧИСТКА БЕЛКА

ОФ ВЭЖХ на колонке YMC C4, 250×4,6, 5 мкм, 300 A (YMC


Co., LTD, Japan).
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА

Аксиальна Аксиальн Аксиаль


ОФ ВЭЖХ Аксиальн
я колонна ая ная
на ая
(Q колонна колонна
колонке колонна
Sepharose (Butyl (Sephacr
Symmetry Sepharos (Q
FF), yl S- 100
300 А e 4 FF), Sepharose
Раствор+б HR ),
Раствор+ле FF,
уфе р 20 Раствор+бу Sephadex Раствор+
йцин овая фер
мМ Трис- G- 25 20 мМ
аминопепти спиртовой
HCL, рН Fine), Na2HPO4 ,
даза 20 мМ
8.0 0,2%
Трис-HCL, Раствор+б глицина,
2М NaCl, уфе р 50 4%
pH 7.0 мМ
1 отщеплен маннитола
Гистидина, , pH
фаза ие N- pH 6,5 6,8
концевого
метионина 2 3 4
фаза фаза фаза
Растан® (Rastan)

Раствор для подкожного введения Цель 1 мл


использования
Соматропин Действующее вещество 5 мг (15 МЕ)
Обеспечение
Натрия хлорид 8,7 мг - 2,94 мг изотоничности
Натрия цитрата дигидрат Регулятор pH
Полисорбат 20 (ПАВ) 4 мг Солюбилизатор
Регулятор pH
Кислота лимонная (1М раствор) до pH
6,0–6,5
Антимикробный
Фенол 2,5 мг консервант
Растворитель
Вода для инъекций до 1 мл
Сайзен® (Saizen®)
Лиофилизат для
приготовления раствора Цель использования 1 фл.
для подкожного
введения
8 мг (1 мг-3 МЕ)
Соматропин Действующее вещество
Сахароза Криопротектор
Фосфорна Буферная система
я кислота
Натрия
гидроксид
Картридж с растворителем
содержит 1,37 мл 0,3%
раствора метакрезола в воде Растворитель с антисептиком
для инъекций
После смешивания содержимого флакона с растворителем получается готовый раствор для инъекций, 1 мл
которого
содержит 5,83 мг соматропина
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ