Analiza cromozomilor

umani
Cromozomii sunt structuri nucleo-proteice, compacte ce contin
informatia genetica responsabila de ereditatea si variabilitatea
Org. Din punct de vedere morfologic sunt alc. din
Cromatide-subunitatile functionale ale cr, la nivelul lor are loc
Replicarea, sunt unitati de replicare
Centromerul reprezinta locul unde cele 2 sub sunt unite, contine ADN inalt
Repetitiv(ADN alpha satelit)asig. Integritatea funct si struct a cr.
Telomerele- sunt regiunile terminale ale cr. Fiecarui brat, sunt
elemente de stabilitate structurala cr, asigura integritatea si indivizibilitatea
Cr. ADN repetitiv de tip palindrom(secventa de care se realizeaza complem
Entaritea in cadrul aceleasi catene, TAAGGG;
Cuplarea in zigoten, capete ce previn scurtarea cr., recunoaste AND defecte
Bratele cr sunt impartite de catre centromer in regiuni egale sau inegale;
De obicei p-brat scurt, q=brat lung
4 indici centromerici:
Lungimea relativa a cr: L re=((p+q)/22+x) 1000
Raportul dintre brate: r=q/p;
Diferenta dintre brate:d=q-p;
Indice centromeric: I c=(p/p+q) 100
Citogenetica

• Studiul cromozomilor si a anomaliilor

cromozomiale:
- in metafaza /interfază (FISH)
- Normal 46 cromozomi: 22 perechi
cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali XX
sau XY
Citogenetica

1/3 din sarcini sunt avortate spontan

• 50% din avorturile de trim I au ca etiologie o

anomalie cromozomială
1% din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii
cromozomiale

• Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane →

analiza cromozomilor la genitori
Cariotip –ordonarea
cromozomilor metafazici în
funcţie de mărime, poziţia
centromerului , prezenţa
constricţiilor secundare şi a
sateliţilor şi a altor
caracteristici morfologice
Metode de cariotipare
• Tipuri de ţesuturi utilizate
– făt/embrion: amniocentesis
– biopsia de vilozităţi coriale

– Adult : sânge periferic (limfocite)

– celule din mucoasa bucală
– fibroblaste
– celule din măduva osoasă
 Metode de cariotipare
• 5 ml of sânge recoltat pe heparină.  
/10ml lichid amniotic obţinut prin
amniocenteză.
• Etapă de centrifugare în vederea obţinerii
unui sediment celular
• Cultivarea celulelor pe medii de cultură
speciale în prezenţa antibioticelor şi a unor
stimulente mitotice (fitohemaglutinina).
• Oprirea diviziunilor celulare în metafaza prin
adăugarea colchicinei (distruge fusul de
diviziune).
• Etape de fixare şi hipotonizare.
• Colorarea preparatelor metafazice şi
vizualizarea lor la microscopul optic.
Prepararea cariotipului
Metode de cariotipare

• cultivarea celulelor pt.48-72h zile

• oprirea diviziunilor in metafază cu colchicină ;
•distrugerea celulelor cu soluţii fixator.

metaphase
• Cromozomii metafazici sunt numerotaţi de
la 1-22 în ordinea descrescătoare a taliei

Braţul scurt
p

Centromer q
(braţul lung)
Centromerul
Centromerul conţine o secvenţa de 171pb repetată de
100000 ori denumită secvenţă alpha satelit
• Telomere :
Extremităţile cromozomilor
Repetiţii TTAGGG
Subtelomerele conţin secvenţe repetate variabile
Constrictriile secundare sunt zone nespiralizate si necolorate
ale cr; se gasesc pe cromozomii 1,9,16, pe bratul Q in apropierea
centromerului, pe cromozomul Y, q median sau pe cromozomii
acrocentrici,p in jurul organizatorului nuclear

satelitii sunt formatiuni extratelomerice situate la nivelul p al

cromozomilor acrocentrici, mai rar pe 17, se datoreaza localizarii
distale a constrictiei sec pe brat; in jurul org nuclear se afla gene
pentru sinteza arn rib(5s,18s,28s)o sub mare:60s(5s+28s), mica
40(18s)
Organizatorii nucleari sunt locusuri informationale, responsabile
pentru decodificarea ADN-ului si sinteza ARN-ribozomal; se
asociaza cu cr. Acrocentrici, in aceste zone in mod exceptional And
este transcris si sintetizeaza nucleoli.
Metode de bandare
• Se folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica clasică
•Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice,cu acizi/baze/tratamente enzimatice şi coloraţi
cu diferiţi coloranţi.

•Metode citogenetice clasice

• Metoda de bandare G – Soluţie Giemsa; evidenţiază heterocromatina intercalara, regiunile de
ADN bogate în A-T; se obtin benzi transversale colorate sau necolorate similare celor din
bandarea Q( cele intens luorecnte vor fi intens colorate si invers, exceptii cr. X, constrictiile sec
1,9,16, care sunt bogate in A,T(bine colorate cu G, neevidentiate cu Q)
• Bandarea Q – substanţe fluorescente (Fluoresceina), heterocromatina constitutiva
extracentromerica intercalata printre zonele eucromatidice; prezinta polimorfisme, variatii
individuale in functie de marimea si intensitatea zonelor fluorescente, studii etnice;se obtin
benzi transversale luorescente sau nu
• Bandarea R – benzi de reversie benzilor G; evidenţiază telomerele şi eucromatina; Preparatele
sunt incubate in solutii alcaline, renaturare si apoi colorate cu Giemsa/acridin orange;
•Bandarea C- pt zona centromerică; tratare cu NAOH, renaturare si giemsa
•Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul constricţiilor secundare ale
cromozomilor acrocentrici.
•Benzile T sunt folosite pentru zonele reziste din bandarea R, se coloreaza cu Giemsa;
telomerele sunt evidentiate printr-o coloratie variabila, verde fluorescenta

•Cariotipare moleculară
• Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
Bandarea G a cromozomilor
 Modelul de benzi este cromozom-
specific

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Aranjarea cromozomilor in cariotip
 Clasificarea cromozomilor în
funcţie de poziţia centromerului
Se vizualizează 350-400 benzi dacă se folosesc
cromozomi metafazici şi respectiv 800 benzi
S ubm e t a ce nt ric
Me t a ce nt ric

dacă se folosesc cromozomi în prometafază

Acroc e nt ric

Metacentrici
Submetacentrici: p= 1/3 din q
Acrocentrici:p=1/5-1/10 din q
Metode de bandare

• Clasificarea
cromozomilor în
funcţie de:
• 1. talie
• 2. pattern de bandare
• 3. poziţia
centromerului
Clasificarea cromozomilor
02_15.jpg
Metode de bandare

Numerotarea Fiecare braţ este Fiecare

cromozomilor împărţit în regiune în
de la 1- regiuni a căror benzi a căror
22+X/Y numerotare se numerotare se
face de la face de la
centromer către centromer
extremităţi către
extremităţile
• Examplu-1q24. regiunii
cromozomul 1, braţul q, regiunea 2,
banda 4
Heterochromatin vs
Euchromatin
 Stabilirea poziţiei unor gene
pe cromozomi

•Gena intoleranţei la
glucoză se află pe 3q26
FISH
Proba locus-specifică hibridizează cu o secvenţă unică de pe un
anumit cromozom. Proba este marcată prin încorporarea în
structura unui anumit nucleotid (Ex: timina) a unei subsranţe
flurescente (fluoresceină, Texas-red, rodamină etc.).
Numărul punctelor fluorescente dintr-o metafază indică indică
numărul punctelor de hibridizare.
Etapa 1: denaturarea dublului helix al ADN-ului probei şi al
cromozomilor metafazici /interfazici în vederea obţinerii de
monocatene prin încălzire la temperaturi ridicate într-o
soluţie de formamidă.
                                                                       
Etapa 2- se adaugă proba peste lama cu cromozomii
metafazici obţinuţi prin tehnica clasică. Lama se acoperă
cu o lamelă pentru a împiedica evaporarea şi se introduce
la incubator la 37C în vederea obţinerii unei reacţii de
hibridizare probă-secvenţă monocatenară cromozomială
.
FISH Probes

telomer
e

centromer
e

whole chromosome paint

locus
FISH

Cromozomii
metafazici sunt
coloraţi cu DAPI, o
substanţă
fluorescentă ce se
leagă de ambele
catene de ADN
Sindroame de
Microdeleţie: probe
locus Specifice
-diagnosticul
microduplicaţiilor
/translocaţiilor
Test FISH pt. a stabili rapid prezenţa unei aberaţii
numerice

Cei 3 cromozomi 21 sunt vizualizaţi cu probe

marcate cu roşu iar cromozomii 13 cu verde.

Identificarea sindromelor de microdeleţie utilizând

probe-control.
William's Syndrome

• Normal Karyotype
Williams del(7q11)
 normal

Prader-Willi del(15q12)
Diagnosticul sindroamelor de microdeleţie
Aneuploidy 13, 18, 21, X and Y
Wolf Hurshorn 4p-
Cri du Chat 5p-
Williams 7q22-
Retinoblastoma 13q14-
Angelman 15q12-
Prader-Willi 15q12-
Miller-Dieker 17p13- Probe pt sdr. De Microdeletie
Smith-Magenis 17p11-
DiGeorge/VCF 22q11-
STS Xp22.3-
SRY Xp22.3-
Kallmans Xp22.3-
Sex X and Y

Subtelomeres (46 probes)

M-FISH 23 chromosomes paints
Centromere for X chromosome 48,XXXX
FISH: Fluorescent
IN SITU hybridization green = probe for end of
chromosome 4

red = control probe for

centromere of the X
chromosome & another probe
for end of chromosome X
• Translocatii

Figure 8.23Bx
Metoda FISH pe nuclei interfazici
Se folosesc probe oligonucleodidice marcate fluorecent pt.
diagnosticul aneuplidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X, si Y

Nuclei de la
acelasi
produs de
conceptie

verde = cromozomul 13 bleu = cromozomul 18

rosu= cromozomul 21 verde = X
rosu = Y
 FISH cu probe marcate
coresumzătoare cromozomului Y
Cromozomi metafazici şi interfazici

FISH pe nuclei interfazici cu probe

pt X marcate cu verde şi pt Y
marcate cu roşu.
Prezenţa de mozaicisme
Diagnosticul genetic prenatal prin metoda
FISH
M-FISH
(SKY)
Cromozomul"Philadelphia "
Translocatie 9:22
 CML

Philadelphia
translocation

Relatively good prognosis in CML Relatively poor prognosis in ALL

Additional chromosome changes: +8, iso(17q), +19,+Ph1, - blast crisis = poor prognosis
Indicatii clinice pentru analiza
cromozomilor
• Deficitul cresterii pre-/postnatale
• Avort spontan/n.n. mort
• Sterilitate/infertilitate
• Istoric familial de rearanjament cromozomial
• Valori anormale ale markerilor serici
materni/anomalii fetale depistate ecografic
• Neoplazii