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1) Marcadores proteicos

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’) Marcadores de ADN

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rincipales aplicaciones de los marcadores
moleculares en fitomejoramiento
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a) Evaluación de la variabilidad genética preexistente.


b) Clasificación por grupos heteróticos (predicción de la heterosis).
c) Determinación de la "core collections" en los bancos de
germoplasma
d) Certificación de pureza de semillas.
e) Identificación y protección legal de variedades.
f) Caracterización e identificación de patógenos.
 
     

a) Selección asistida por marcadores moleculares.


b) QTLs o "Quantitative Trait Loci" loci de rasgos cuantitativos.
c) Backcross asistido (introgresión rápida de caracteres de interés).
d) Backcross avanzado desde genotipos "no agronómicos" o
especies silvestres

    

a) Construcción de mapas genéticos.


b) Determinación de homología entre especies relacionadas por
mapeo comparativo.
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asos generales de un protocolo de extracción a partir de cualquier


tejido y especie:

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åBuffer de extracción (pH 8-9) d Disminuye la acción de ADNasas

åAntioxidantes d Disminuye la formación de compuestos fenólicos


p.e. BSA -mercaptoetanol

åDetergente + alta concentración salinad acomplejamiento del ADN y


desnaturalización de proteínas
p.e. CTAB +ClNa
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åLavado para remover carbohidratos y proteínas d solventes


orgánicos puros o en mezcla (p.e. fenol o cloroformo:alcohol
isoamílico )

åCentrifugación dseparación del ADN en suspensión de los


contamientes

årecipitación d isopropanol o etanol

åuede realizarse un tratamiento con ARNasas o purificación en


gradiente de ClCs para eliminar ARNs y obtener ADN de mayor
pureza.

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Método CTAB
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åiluorómetro: el valor leído se intercala sobre una curva de calibración


previa y se extrapola la concentración de las muestras.

åEspectrofotómetro de luz UV
d Mediciones de absorbancia a longitudes de onda de A ’ A’ A’80
y A 310
å A ’ 0 / A ’80 < 1 8 d Contaminación con proteínas
å A ’ 0 / A ’80 > 1 8 < ’ d Buena calidad
å A ’ 0 / A ’80 > ’ d Contaminación con fenoles cloroformo etc

Alta precisión pero pueden verse afectadas por la presencia de


contaminantes como proteínas polisacáridos y ARNs.

åDiluciones con un estándar de ADN comercial de concentración conocida


con bromuro de etidio. Se observan las diluciones a la luz UV en forma
conjunta con los ADN incógnitas y se estima la concentración por
comparación.
å*eles de cuantificación (agarosa 0 8%) con marcadores de peso
molecular conocido para cuantificar los ADN extraídos por comparación
de bandas.
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å Endonucleasas

åCapaces de cortar el ADN en sitios de secuencias de bases


específicas d G   
åTipos de corte

åEn el centro de simetría de la secuencia de reconocimiento

roduce fragmento de ADN con extremos


³romos´ o³rasurados

åEn diferentes posiciones del eje de simetría de la secuencia


de reconocimiento

roduce fragmento de ADN con extremos


³cohesivos´ o³pegajosos´
0rigen y secuencias de reconocimiento de algunas
endonucleasas de restricción

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Digestión de ADN con enzimas de restricción

å Se generan fragmentos de diferente tamaño llamados


p x  p  p

å Un ADN pequeño como el de un cloroplasto puede generar


40 segmentos de restricción cuando se digiere con EcoRI

å El tamaño de los fragmentos refleja la distribución de los


sitios de restricción en el ADN

å Estos fragmentos cargados negativamente migran hacia el


ánodo en un campo eléctrico

å Durante la electroforesis en geles de agarosa o


poliacrilamida migran en el gel a una tasa proporcional a sus
pesos moleculares
Electroforesis de ADN
d Los geles usados en la separación
de ácidos nucleicos son matrices de
agarosa o poliacrilamida con tramas de
dimensiones moleculares.

d Los ácidos nucleicos están cargados negativamente ellos


emigran hacia el polo positivo en un campo eléctrico.

d Cuando el campo eléctrico se aplica a


través del gel las cadenas más cortas se
mueven más rápidamente que las más
largas. Así las cadenas se extienden en el
gel según su tamaño.
d El ADN   puede ser visualizado agregando bromuro
de etidio un químico aromático que se intercala entre los pares de
bases de la hélice doble. Cuando el bromuro de etidio se halla ligado
al ADN produce al irradiarse con UV una fluorescencia naranja.

d La diferencia en los
tamaños de los fragmentos
obtenida por la digestión con
enzimas de restricción del
ADN nuclear de una organela
* $     o el ADN total se denomina
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