Метаболические

стрессы
Е.В. Проскурнина
Proskurnina@gmail.com
Метаболизм
• набор химических реакций, которые возникают
в живом организме для поддержания жизни.
• Есть нормальные метаболические пути и
патологические (стрессы).
• Сегодня мы рассмотрим несколько
патологических метаболических путей,
связанных с активными формами кислорода и
азота (АФКА).
Метаболические
пути
• Катаболические –
происходит
разрушение
молекул
с
высвобождением
энергии
• Анаболические –
синтез биомолекул с
потреблением
энергии
• Амфиболические – в
зависимости от
потребности в
энергии могут быть
анаболическими или
катаболическими
Примеры
метаболических путей
• Цикл лимонной кислоты (Кребса) (митохондрия)
• Электронная транспортная цепь (митохондрия)
• Гликолиз (цитозоль)
• Пентозо-фосфатный шунт (цитозоль)
• Синтез жирных кислот (цитозоль)
Single lines: pathways common to most lifeforms. Double lines: pathways not in humans (occurs in e.g. plants, fungi,
prokaryotes). Orange nodes: carbohydrate metabolism. Violet nodes: photosynthesis. Red nodes:
cellular respiration. Pink nodes: cell signaling. Blue nodes: amino acid metabolism. Grey nodes: vitamin and
cofactor metabolism. Brown nodes: nucleotide and protein metabolism. Green nodes: lipid metabolism.
Химические
схемы некоторых
путей
Участники метаболизма
• Субстраты (исходные вещества, например,
глюкоза, пируват)
• Ферменты (катализаторы)
• Кислород
• Продукты реакции (вода, углекислый газ,
спирты)
• «Помощники» - коферменты и кофакторы
(НАДН, НАДФН, ФАД, коэнзим Q, ацетил-
коэнзим А)
• Источники энергии (АТФ, АДФ)
Свободный радикал

Правило октета нарушено – свободный радикал является

высоко реакционно-способной частицей
 Триплетный и синглетный
кислород

Молекула кислорода О2 является

бирадикалом (триплетный
кислород)
История исследования
свободно-радикальных
процессов
Еще в 1977 году химия свободных
радикалов считалась
Золушкой органической
химии
Слово «радикал» впервые
употребил Лавуазье в
кислородной теории
(1789).
Он назвал радикалами любые
вещества, при соединении с
кислородом, образующие
кислоту.
Потом радикалами стали считать
неизменные части молекул (XIX
в)
 Берцелиус, Понтин, Дэви – радикал аммония,
Кольбе – «свободный метил», впоследствии
оказавшийся этаном.
Франкланд – «свободный этил», впоследствии
оказавшийся бутаном.
После того, как Каниццаро предложил метод
определения молекулярных масс, ученые стали
отрицать существование свободных радикалов
вплоть до 1900 года
 Мозес Гомберг, отец свободно-
радикальной химии, в 1900 году
впервые описал свободный радикал
Тритил – радикал
трифенилметана

Моисей Георгиевич Гомберг

Пытаясь получить гексафенилэтан, он выделил реакционноспособное соединение,
имеющее в растворе интенсивную окраску, и доказал, что это соединение
(трифенилметил) представляет собой "половину" молекулы.
В 1928 году Фридриху
Панету удалось поймать
свободные радикалы в
газовой фазе
Дальнейшие исследования
1928 – Н.Н. Семенов открыл механизм цепных
(свободно-радикальных) реакций,
1929 – Г.А. Разуваев и В.Н. Ипатьев доказали
существование свободных радикалов в
растворах,
1937 – опубликован знаменитый обзор Хэя и
Уотерса, в котором обосновывалось участие
свободных радикалов как промежуточных
продуктов во многих реакциях.
Свободные радикалы в
биологических
процессах
О. Варбург и Л. Михаэлис – предположение
о свободных радикалах как промежуточных
участниках биологических процессов (1939),
А.Г. Гурвич – идея о роли свободных
радикалах в действии митогенетических
лучей,
 А.А. Красновский – радикалы как
первичные продукты фотосинтеза
(1956),
Д. Харман – свободно-радикальная теория
старения (1955) (умер в 2014 году в возрасте
98 лет)
История открытия
Хармана
• Исходил из того, что люди, подвергшиеся
облучению, быстрее стареют.
• Облучение связано со свободно-радикальными
процессами.
• Вывод: старение связано со свободными
радикалами.
• Крысы на антиоксидантной диете оставались
более молодыми на 30%.
• Итог: антиоксидантная терапия не
увеличивает
срок жизни, но увеличивает время
«молодости».
Некоторые статьи
из PubMed
• «Free radical production in oxidation-reduction
reactions of peroxidase, catalase and
metmyoglobin» George P. Irvine DH. (1954)
• «Oxygen poisoning and X-irradiation – a
mechanism in common» Gerschman, R. (1954)
• «Molecular product and free radical yields of
ionizing radiations in aqueous solutions». Hart
E.J. (1954)
•
Методом ЭПР показано образование
свободных радикалов в
живых системах
• Free radicals in biological materials. Commoner B.,
Nature (1954)
Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон
методом ЭПР обнаружили радикалы
в белках
Блюменфельд Л. А., Калмансон А. Э., Спектры
электронного парамагнитного резонанса
биологических объектов, влияние
денатурации на спектры ЭПР облученных
белков. Биофизика (1958)
Прибор собирали своими руками с 1952 до
1955 года. В декабре 1955 г. «был получен
первый сигнал ЭПР от стабильного
свободного радикала
дифенилпикрилгидразила...»
Последовала серия работ по влиянию
радиоактивного облучения на аминокислоты
и белки
Развитие свободно-
радикальной биологии
• 1968 – Knowles изучал восстановление
кислорода при участии ксантиноксидазы
методом ЭПР и обнаружил радикал, который он
назвал «супероксидным».
• 1968-1969 – Ирвин Фридович и Джо МакКорд
открыли супероксиддисмутазу.
История изучения слабого свечения
тканей и клеток животных и
человека
Год Автор Объект Метод
1924 А. Г. Гурвич Клетки растений и Митотический индекс
животных или число почек

1934 Г.М. Франк, Химические Счетчик фотонов

С. Родионов реакции, дрожжи

1938 Р. Одюбер Химические Счетчик фотонов

(R. Aubert) реакции

1952 А. Стрелер Послесвечение ФЭУ, охлаждаемый

(A. Strehler) листьев растений жидким азотом

1954 Л. Коли и сотр. Проростки ФЭУ, охлаждаемый

(L. Colli et. al.) растений твердой углекислотой

1959 Ю.А. Владимиров, Дрожжи, мышца ФЭУ, охлаждаемый

Ф. Ф. Литвин жидким азотом
Хемилюминесценция как метод
исследования свободных радикалов
Термин «люминесценция» – 1888, Э. Видеманн. Он
же привел классификацию люминесценции на
шесть вариантов: фото-, термо-, электро-, трибо-,
кристалло- и хемилюминесценция,
 Открытие люминола – 1928, Альбрехт,
 Синтез люцигенина – 1935, Глой и Петч,
Конец 1950-х – разработка приборов и
чувствительных ФЭУ,
группа Р.Ф. Васильева разрабатывает метод
активированной ХЛ - 1960.
 ХЛ начинает применяться для
исследований
свободно-радикальных реакций в биологических
системах.
Robert Allan Юрий Владимиров A.U. Khan. Открыл
Открыл ХЛ (1959). ХЛ при реакции
нейтрофилов в Сверхслабое гипохлорита с
1971 году. свечение животных H2O2 в 1970 г.
тканей.

Берлин 1997
Лайнус
Полинг
• Прожил 93 года,
• Теория об особой роли витамина C,
• Ежедневно принимал 1 – 2 грамма
аскорбиновой кислоты,
Метаболические
стрессы
Оксидативный

Карбонильный

Нитрозативный

Редуктивный
27
Оксидативный
стресс
Свободные радикалы в
организме человека
1985 – концепция оксидативного
стресса как
патологического состояния

К настоящему моменту в PubMed

опубликовано около чем 11100
работ, в которых «free radical» или
«ROS» упоминаются в названии.
 Оксидативный
стресс

нарушение баланса между продукцией свободных радикалов и активностью

антиоксидантного контроля за их содержанием, которое сопровождается
31
повреждением клетки
Оксидативный стресс
как упрощенная модель

Активные
формы, Мишени,
проокси- анти-
оксидант P
дантные ная
факторы
система

Участники оксидативного стресса: Продукты -

Активные формы и маркеры
прооксидантные факторы и окислительного
мишени их воздействия, в том стресса
числе антиоксидантная
система
32
Химические превращения при
оксидативном стрессе

33
Frijhoff J. et al. Antioxid Redox Signal. 2015 Nov 10; 23(14): 1144–1170
Кратко: основные
повреждающие процессы
• Окисление липидов, в том числе, липидная
пероксидация (перекисное окисление липидов),
• Окислительная модификация белков в разных
вариантах (окисление SH групп,
карбонлирование, нитрозирование,
хлорирование)
• Окислительная модификация ДНК
 Молекулярные мишени
активных форм кислорода/азота
(АФКА)
Перекисное окисление ненасыщенных Окислительное повреждение
липидов мембран: нарушение
мембранного транспорта, работы белков,
изменение структуры и жесткости
мембран
АФКА
митохондриальной и клеточной ДНК (ОН-
радикал): реакция с дезоксирибозной
группой ведет к одноцепочечным разрывам
и выпадению оснований, различным
модификациям сахаров и образованию АР-
сайтов (участков с удаленными
азотистыми основаниями); кроме того,
возможны широкий спектр окислительных
модификаций оснований и кросс-сшивки
ДНК-белков.

Окислительная модификация белков:

кросс-сшивки, фрагментация белков, сайт-специфические
повреждения белковой молекулы, изменяющие ее
структуру и влияющие на функциональную активность
белка
 Основные маркеры
ОС
Гидроксиноненаль

Окисление тиольных групп Малоновый диальдегид

Карбонилы белков Изопростаны

Окисленные
тирозин, метионин,
триптофан Окисленные основания

Нитр Нитрозированные основания

озир
Clinical Relevance of
Biomarkers of Oxidative
Stress Frijhoff J. et al.
Antioxid Redox Signal.
2015 Nov 10; 23(14): 1144–1170

37
Методы анализа маркеров ОС
и антиоксидантов
ELISA – «золотой» стандарт клинических
исследований ОС (enzyme-linked
immunosorbent assay)
 Иммунофлуоресценция, иммуноблоттинг
 Спектрофотометрия
 Comet Assay (электрофорез +
флуоресценция)
 Высокоэффективная жидкостная
хроматография

Хромато-масс-спектрометрия – «золотой»
Современная концепция
оксидативного стресса
 Утверждает необходимую роль АФК в процессах
сигналинга, апоптоза, пролиферации клеток и др.,
учитывает не только прямое повреждение АФКА белков,
липидов, ДНК, но и опосредованное влияние, через
редокс- или АФК-зависимые сигнальные пути,
Учитывает взаимосвязь оксидативного стресса с
карбонильным, редуктивным, нитрозативным,
проводит различие между системным и локальным
оксидативным стрессом,
считает перспективной оценку состояния оксидантно-
оксидантного статуса у людей и коррекцию
оксидативного стресса при патологии.
Связь с другими
патологическими
процессамиДегенеративные процессы,
старение

Гипоксия
Воспаление, в том
(ишемия/репер- ОС числе аутоиммунное
фузия)

Опухолевый рост

40
 Oxidative stress in
title: Pubmed

Giustarini, D., I. Dalle-Donne, et al. (2009). "Oxidative stress and human diseases: Origin, link,
measurement, mechanisms, and biomarkers." Critical reviews in clinical laboratory sciences
46(5-6): 241-281
 Оксидативный стресс
в медицине
2000 2012 2001

2003
2012 1994

42
Заболевания, связанные с
оксидативным стрессом

Репродуктивная система
 Отсутствие ОС –
необходимое условие
здоровья
Institute of Health, Florida,
USA
http://www.freeradicaltherapy.co
m/

• Кислотно-основной
дисбаланс
• Тенденция к анаэробному
метаболизму
• Избыток свободного
кальция
• Хроническое воспаление
• Нарушения
соединительной
 Терапия антиоксидантами –
задача, требующая
решения Данные мета-анализа больших
рандомизированных клинических
исследований говорят об
противоречивых эффектах
антиоксидантной терапии

Средиземноморская «диета», данные

отдельных небольших клинических
исследований
свидетельствуют о положительном
эффекте приема антиоксидантов
Карбонильный
стресс
Понятие карбонильного стресса
было предложено Миятой (1998)
• Он определил карбонильный стресс как
ситуацию, возникающую в результате
• 1) усиленного окисления углеводов и липидов
или
• 2) недостаточной детоксикации или
инактивации карбонильных соединений,
образованных из углеводов и липидов путем
окислительных или неокислительных процессов
Структуры некоторых
карбонильных соединений
(>С=О)
Источники карбонилов в
организме
• Эндогенные карбонилы могут быть образованы
как промежуточные продукты в результате
ферментативных процессов (гликолиз,
полиоловый путь, окисление аминокислот), но в
этих метаболических путях карбонилы, за
некоторым исключением, эффективно
утилизуются.
• Большая часть избыточных карбонилов
образуется в результате неферментативных
процессов – гликирования и липидной
пероксидации
Реакция Майяра – сахароаминная
конденсация, взаимодействие
аминокислот с моносахаридами

Луи Камиль Майяр

Карбонилы образуются в
результате липидной пероксидации
Связь карбонильного и
оксидативного стресса
Реакция Майяра может
происходить в организме при
избытке сахаров
• Карбонильные соединения, являясь электрофильными, обладают
высокой реакционной способностью по отношению к биологическим
нуклеофильным молекулам (тиолы, имидазолы, гидроксильные группы
молекул, пуриновые и пиримидиновые основания). Особенно
высокореакционны ненасыщенные альдегиды, такие как акролеин.
• В белках атакуются лизин, гистидин, аргинин и триптофан, наиболее
уязвимые с химической точки зрения, их молекулы содержат свободные
аминогруппу (–NH2), гуанидиновую группу (–С(NH2)2), индольное и
имидазольное кольца.
• В ходе этой реакции между восстанавливающей формой сахаров и
аминогруппами белков (лизина или N-концевой аминогруппы)
образуется
продукт Амадори, или фруктозамин (фруктозил–лизин), который в
процессе дальнейших реакций и преобразований превращается в т.н.
конечный продукт гликирования (AGE, advanced glycation end products,
ALE, advanced lypoperoxidation end products).
• Взаимодействие карбонилов с нуклеофильными группами биомолекул
может привести к необратимой химической модификации белков,
нуклеиновых кислот и аминофосфолипидов, давая огромное количество
аддуктов и продуктов сшивки, например МДА-Lys, HNE-Lys, пропаналь-Hys,
пропеналь-lys
Мишени карбонилов
и защита от них
• По сравнению с АФК, карбонильные соединения
относительно стабильны.
• Отсутствие заряда на молекуле и относительно
большое время жизни (часы) позволяют им
диффундировать через клеточную мембрану и атаковать
мишени далеко от места продукции.
• Накопление карбонильных соединений приводит к
цитотоксическим и генотоксическим эффектам.
• Как и при оксидативном стрессе, в организме
предусмотрена «антикарбонильная» система защиты. В
основном это ферменты класса альдегиддегидрогеназ,
альдегидоредуктаз и глутатионтрансфераз. Наиболее
мощным путем детоксикации альдегидов является их
ферментативное связывание с глутатионом в глутатион-
трансферазной реакции.
Заболевания, при которых
карбонильный стресс
играет важную роль
• Сахарный диабет (!)
• Атеросклероз и другие сердечно-сосудистые
заболевания
• Старение
• Нейродегенеративные заболевания
Нитрозативный
стресс
NO – молекула года
(1992)
• Эндотелиальный
сосудорасширяющий фактор
(EDRF, Endothelium-derived
relaxing factor)

Роберт Фрэнсис Ферчготт,

лауреат Нобелевской
премии по физиологии и
медицине 1998 года «За
открытие роли оксида азота
как сигнальной молекулы в
регуляции сердечно-
сосудистой системы».
Строение и
свойства молекулы
NO
Молекула NO малополярная, линейная, длина связи составляет 0,115 нм, её
строение описывается двумя резонансными структурами, обе формы имеют один
неспаренный электрон, поэтому молекула является радикалом, но при обычных
условиях не склонна к димеризации.

 Легко проходит сквозь липидную мембрану

 Высокая реакционноспособность
 Период полуреакции от 2 до 30 мс
 Про- и антиоксидант
 Реагирует с супероксидом, образуя пероксинитрит
Метаболизм NO и образование
активных форм азота
Редуктивный
стресс
Избыток
восстановителей
• НАДН-зависимый редуктивный стресс
(псевдогипоксия, состояние, когда не может
эффективно потребляться кислород)
• Глутатион-зависимый редуктивный стресс

• Наследственная кардиомиопатия, болезнь

Альцгеймера.
Глутатион – важнейший
антиоксидант
 НАДН –
кофермент
оксидоредуктаз
Реакции, катализируемые оксидоредуктазами, в общем виде выглядят так:

Восстановитель (НАДН) + окислитель → НАД+ + продукт

• Цикл трикарбоновых кислот

• Митохондриальная дыхательная
цепь
• Гликолиз
• Бета-окисление жирных кислот
• Глюконеогенез
Спасибо за внимание!