Universidade Federal do Esprito Santo

MARCADORES MOLECULARES

CONCEITO

Todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento de DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1996).

Portanto, so partes do DNA que so utilizadas na identificao, para se fazer analises comparativas entre seres distintos.

TIPOS
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) SNP (Single Nucleotide Polymorphism) STR (Short Tandem Repeat)

RFLP
(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrio)

Consiste na fragmentao do DNA atravs do uso de enzimas de restrio e na hibridizao desses fragmentos com seqncias homlogas de DNA marcadas por compostos radioativos ou luminescentes. Para a deteco do polimorfismo necessrio que as seqncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos comparados sejam distintas.

Causas dos polimorfismos

Criao ou eliminao de stios de restrio: substituio ou modificao de pares de bases (mutao); delees, inseres,inverses ou translocaes ocorridas na fita de DNA. Consequncia: Alterao da distncia entre dois stios de restrio adjacentes.

RFLP
(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrio)

Extrao e purificao do DNA; Clivagem de molculas de DNA por

enzimas de restrio; eletroforese em gel;

 Separao dos fragmentos por Southern blot;  Visualizao em forma de bandas.

Ex1

Ex.: Milho e sorgo(mapeamento comparativo) Enquanto o milho possui cerca de 4 picogramas de DNA
o sorgo possui apenas 1 picograma. Apesar de tamanha disparidade no tamanho fsico do genoma estas espcies possuem ampla sintonia genmica . O locus de RFLP em sorgos revelaram conservao das ligaes com os mapas de ligao do milho e a maioria dos locus ligados em milho tambm se mostrou ligados em sorgo. A ordem dos locus tambm foram em grande parte conservadas. Segmentos distintos, duplicados em milho, tendem a corresponder a uma nica regio genmica em Sorgo, o que explica o maior tamanho fsico do genoma do milho. Resultado: Elaborao da hiptese de escala evolucionria: mostra que o milho surgiu antes do sorgo.

Aplicaes
Biossistemtica, evoluo e gentica de animais e plantas; Estudos de gentica de populaes, biogeografia e polimorfismo em populaes de diversos organismos; Medicina forense, determinao de paternidade e no diagnstico de doenas hereditrias.

Limitaes da tcnicas de RFLP

Processo de alto custo; Grande investimentos em pessoal, equipamentos, qumicos; Cuidados especiais quando sondas radioativas so empregadas; No permite a automatizao de suas etapas.

VNTR(Minisatlite) (Repeties em tandem de nmero varivel)

Nmero varivel de seqncias idnticas repetidas lado a lado com 15 a 100 pares de bases e so repetidas at 50 vezes em cada loco hipervarivel.

A obteno e deteco destes tipos de marcadores tm princpio semelhante ao utilizado para RFLP. A nica diferena entre os marcadores RFLP e VNTR o tipo de sonda empregada na deteco do polimorfismo de DNA. As sondas so homlogas s seqncias repetidas dos minisatlites, de forma que so detectados todos os locos hipervariveis simultaneamente, sendo obtido um perfil complexo de bandas mltiplas.

Ex.: Teste de paternidade

Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA, correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivduo. Metodologia: Extrao de DNA genmico; Digesto com enzima de restrio:Hae III, Pst I e Hinf I; os produtos da digesto so separados em gel de agarose, desnaturados; Southern-blot. Uma sonda quimioluminescente, ou marcada radioativamente, complementar s seqncias detectar as seqncias alvo; visualizao em filmes de raios-X; A mesma membrana, com o DNA fixado, pode ser utilizada para hibridizaes seqenciais com diferentes sondas, especficas para seqncias VNTR em diferentes cromossomos .

De maneira geral, como resultado da utilizao de apenas 5 sondas VNTR, so obtidos ndices de paternidade/maternidade superiores a 100.000, gerando probabilidades de paternidade/maternidade superiores 99,999%. Desvantagens: Requer DNA ntegro e em grande quantidade, tornando praticamente invivel a tipagem de amostras biolgicas antigas, degradadas ou com pouca quantidade de DNA. Por isso, a metodologia pouco utilizada em investigaes criminais.

Teste de paternidade
Enzima de restrio

RAPD
(Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso)

O princpio desta tcnica o uso de primers mais curtos (10 nucleotdeos) e de seqncia arbitrria durante a reao de amplificao, eliminando a necessidade do conhecimento prvio da seqncia.

RAPD
Metodologia: Escolha de arbitrria ; um primer de sequncia

Amplificao em gel de agarose, corado com Brometo de Etdio e visualizado sob luz UV. As duas regies do genoma complementares ao primer devem estar separados por at 4000 pares de bases e orientaes opostas; Produtos da amplificao separados em gel de poliacrilamida; Bandas visualizadas por autoradiografia ou por Nitrato de Prata.

RAPD
Os marcadores RAPD se comportam como marcadores genticos dominantes, ou seja, um indivduo diplide homozigoto para um dado loco RAPD possui dois alelos RAPD idnticos (AA), a partir dos quais ocorre a amplificao; O indivduo heterozigoto (Aa) para o mesmo loco RAPD possui um alelo (A) que amplificado e o outro (a) que no ; j o gentipo homozigoto recessivo (aa) identificado pela ausncia de banda no gel.

Vantagens do RAPD em relao ao RFLP

Dados obtidos mais rapidamente ; Pode ser utilizado um conjunto nico de primers arbitrrios; preciso uma quantidade mnima de DNA para a anlise genotpica de um indivduo; Possibilita amostrar regies de DNA repetitivo; Tcnica mais sensvel na deteco de polimorfismo ao nvel de DNA devido aos primers serem curto; Apresenta custo mais baixo, em virtude dos gastos com mo-de-obra, reagentes e suplementos serem menores e no necessitar de instalaes sofisticadas de laboratrio.

Ex.:
Identificao de populaes de cochonilhas Na regio mitocondrial 16S rDNA o gene tem sido usado em inmeros estudos em relaes filogenticas. No instituto tropical de agricultura, tem utilizado tcnicas de RAPD para caracterizar diferentes populaes de cochonilhas e caracterizar o gene mitocondrial do rDNA de quatro populaes representadas por trs espcies da frica e Amrica do Sul. um mtodo diagnstico para uma rpida identificao das espcies.

Ex. Identificao de espcies Capsicum sp. (pimento/pimenta) Em estudo da diversidade gentica e classificao botnica em 70 exemplares do gnero, observou-se que o marcador RAPD foi eficaz para estimar a diversidade gentica e agrup-los em espcies. Desta forma esse marcador molecular pode ser usado na classificao de espcies no identificas botanicamente e na reclassificao de alguns indivduos erroneamente identificados apenas por padres morfolgicos.

SNP Polimorfismo de nucleotdeo nico

Variao na sequncia de nucleotdeos do DNA que ocorre quando um nico nucleotdeo alterado em regies codificantes ou no-codificantes. Para uma variao ser considerada SNP necessrio que esteja presente em no mnimo 1% da populao. Muitos SNP no possuem efeito da funo celular, porm cientistas acreditam que possam influenciar na predisposio a doenas e a respostas a drogas.

Metodologia
PCR- amplificao do alelo especfico; Cada alelo na amostra quantificado. Isto amostrado dividindo alquotas iguais do DNA analisado em duas reaes de PCR distintas, cada uma contendo um par de primers especfico para uma ou outra variante do alelo do SNP; Para amostras com iguais quantidades dos dois alelos podese detectar mesma quantidade de ciclos de fluorescncia; Para alelos distintos, h um desequilbrio da proporo do nmero de ciclos de fluorescncia, o que utilizado para calcular a quantidade relativa de alelos diferentes.

Aplicaes:

Deteco para pr-disposio gentica para doenas como: Diabetes Tipo II; Hipertenso arterial; Alzheimer.

Alm de estudos para o melhoramento de carcteristicas vegetais.

EX.: Pr-disposio ao Alzheimer

Um dos genes associado ao Alzheimer, ApoE, um bom exemplo de como os SNPs podem afetar o desenvolvimento de doenas. Esse gene contm dois SNPs, o que possibilita trs possibilidades de alelos para esse gene E2, E3, E4. Em cada alelo alterado apenas uma base e a protena produzida por cada gene difere em apenas um aminocido. Cada indivduo herda uma cpia de ApoE do pai e outra da me. Pesquisas mostram que um indivduo que herda no mnimo um alelo E4 possui chance muito maior de ter Alzheimer. A herana do alelo E2, ao contrrio, parece indicar que o indivduo tem menos propenso de desenvolver a doena. Constata-se a importncia do estudo dos SNPs para a deteco precoce da pr-disposio a certas doenas.

STR(Microssatlite) Pequenas regies em tandem

So sequncias de 2- 6 pares de bases em tandem. Distribui-se uniformemente por todo genoma humano. Eleita para a tipagem por DNA de vestgios biolgicos em geral devido a sua simplicidade tcnica, a pequena quantidade de DNA requerida, ao baixo custo, ao grande poder de resoluo e aos altos nveis de polimorfismo.

Metodologia
Tcnica de PCR, onde vrios pares de primers orientam simultneas reaes de amplificao, gerando produtos de mltiplos loci. Os alelos amplificados so separados em eletroforese em gel de poliacrilamida. Tecnologia avanada: Acoplou-se a produo de primers marcados com diferentes corantes fluorforos e sistemas de deteco a laser em aparatos de separao eletrofortica. Os produtos de PCR marcados com fluorocromos podem ser detectados em tempo real mediante eletroforese capilar ou pode-se realizar a deteco pseletrofortica em escaner de fluorescncia

Aplicaes
Monitoramento

de transplante de clula do tecido hematopoitico; Teste forense; Reconstruo filogentica.

EX.:Rastreamento de linhagens paternas

Uma seqncia especfica dos cromossomos X e Y, denominada amelogenina, tambm pode ser amplificada simultaneamente em um sistema multiplex, proporcionando a determinao do sexo do indivduo doador da amostra biolgica.

Este haplotipo transmitido de pai para filho, ou seja, perpetuado pelas geraes descendentes. Portanto, a tipagem de STRs de cromossomo Y proporciona o rastreamento de linhagens paternas.

Com anlises de STR pde-se mondar uma rvore filogentica que aponta trs diferentes grupos basais que correspondem trs grupos tnicos Africano, Caucasiano e Oriental

Referncias
Marcadores moleculares / Aluzio Borm, Eveline Teixeira Caixeta, editores. Viosa, MG, 2006. 374p. :il. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/snps.shtml#snps (acessado em 27/04/2007) http://www.crbm1.com.br/bio65/artigocien_65.asp (acessado em 27/04/2007) http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL003.htm(acessado em 28/04/2007) http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_ci13_1.htm (acessado em 28/04/2007) http://www.cnpsa.embrapa.br/met/palestra06.pdf (acessado em 28/04/2007) http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=402&ordem=0&canal=5 (acessado em 28/04/2007) http://www.cpatsa.embrapa.br/catalogo/livrorg/marcadormolecular.pdf (acessado em 29/04/2007) Griffits,I.S.,Anthony.2002 . Introduo gentica 7. Ed.Guanabara.Vogan.794p.