Prof. MSc.

Jos Antonio Romero Palmera

Brbula, Febrero 2009

Objetivo General:
Especificar las herramientas que utiliza la histologa para el estudio ultraestructural de tejidos y de la clula como unidad morfolgica y funcional del organismo.

Contenido
Histologa: Concepto y aplicaciones cientficas y clnicas. Tcnica histolgica: Etapas en la preparacin de tejidos para su estudio al microscopio ptico y electrnico. Histoqumica y Citoqumica: Aplicacin, tipos, fundamentos qumicos de la coloracin. Microscopa: Tipos de microscopios y aplicacin. Microscopio ptico: funcionamiento. Microscopio electrnico: de transmisin barrido.

partes, y de

Del griego Histo Logos Tejido Tratado

Ciencia que estudia los tejidos orgnicos: su estructura microscpica, su desarrollo y sus funciones

Aplicaciones cientficas y clnicas

Serie de pasos que han de darse para obtener un preparado observable con el microscopio ptico
Toma de muestra Inmediato (in vivo) Mtodos de examen Mediato (post mortem) Fijacin Deshidratacin Preparacin para la inclusin Inclusin Modelado catalogacin Seccin con el micrtomo del bloque

extendido de los cortes pegado Coloraciones: especiales de rutina o

El muestreo debe realizarse antes de:

Autlisis y/o Putrefaccin

Los tejidos y rganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:

Las glndulas exocrinas y endocrinas lo ms rpidamente posible. El pncreas y el rin deben extraerse no ms de 10 a 15 min. Otros rganos tales como intestino delgado y/o grueso, estmago, hgado, se deben extraer no ms all de los 30 min. Los msculos esquelticos, huesos, piel, encfalo, mdula, ganglios nerviosos no deben extraerse ms all de 60 min.

No deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ngulos rectos a la superficie de los rganos. A veces pueden cortarse trozos de rganos de mayor tamao, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en fijador en que las piezas estn ms fciles de manejar, se realizan cortes ms pequeos de los mismos. La cantidad de lquido fijador en microscopia ptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.

24 horas

Es una operacin destinada a provocar la MUERTE de las clulas, conservndolas, cuanto sea posible en el estado en que estn durante la vida. Una buen a fijacin debe: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.) 2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.) 5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella 6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos

Coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor) Formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales) Reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro)

La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos

SIMPLE S

Formol al 10% Alcohol etlico absoluto o de 96% Alcohol metlico cido smico al 1 2% Bicromato de potasio al 3-5%

Qumicos

COMPUESTOS Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica. Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica. Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica. Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico

FSICOS

Desecacin, Calor seco, Calor h medo, Fro y Congelacin y desecacin

Deshidratacin
Los tejidos contienen grandes cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina Lavado en agua o alcohol

Una lmina en un caja de deshidratacin

La deshidratacin se hace en forma progresiva con sucesivos ba os de alcohol, cada vez menos hidratados 8

Tiempos de permanencia en cada lquido: Alcohol : las piezas pueden permanecer varios das. Alcohol : 2 ba os en un lapso de 24 h. : 3 ba os de una hora c/u. Alcohol

Aclaracin
Impregnacin por un disolvente de la parafina Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente (xilol o toluol)

Penetracin de la Parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-5 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina

Inclusin Definitiva o Formacin del Bloque

En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin.

15-30 minutos

Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera

CORTES
El objeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones. Micrtomo de deslizamiento Micrtomo Tipo Minot Micrtomo de Congelacin y el Cristato o Critomo
Micrtomo tipo Minot

Los cortes de parafina se extienden en agua tibia contenida en un cristalizador. Se introducen portaobjetos, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta

Tincin o Coloracin de los Cortes

Corte Deshidratado y Montado en un Portaobjeto

Desparafinar los cortes con xilol Rehidratar con alcoholes de gradacin decreciente (100%, 50%....agua) Coloracin Aclarar el exceso de colorante con agua Deshidratar

Montar (Resina + Cubreobjetos)

Coloracin
Proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente

Colorante
Sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos Clasificacin COLORANTES NATURALES: Animales (carmn) Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn)

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA) cidos, Bsicos, Neutros e Indiferentes

COLORANTES BSICOS Sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Reaccionan con los GRUPOS ANINICOS de los componentes texturales, que son los grupos: Fosfatos de cidos nucleicos (ADN y RNA) Sulfatos se los glucosaminoglucanos Grupo Carboxilo de las protenas. La reaccin de estos grupos vara segn el pH. Son colorantes nucleares Ejemplos: Verde de Metileno, Azul de Metileno, Pironina G, Azul de toluidina y la

Hematoxilina

Los t ji os que reaccione con un colorante bsico (o con Hematoxilina) se dice que es BASFILO y que presenta BASOFILIA. stos componentes son: La Heterocromatina y los Nucl olos del Ncleo por los grupos Fosfato ioni ados. rgatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ioni ados. atri del Cartlago por grupos Sulfato ioni ados.

COLORANTES CIDOS Sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de sodio) Se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes bsicos Las anilinas cidas reaccionan con grupos catinicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las protenas Son colorantes citoplasmticos
Los componentes texturales que se tien de colorantes cidos se dice que son ACIDFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son acidofilos: La mayor parte del citoplasma no especializado. Filamentos Citoplasmticos. Fibras extracelulares

Hematoxilina Eosina
La hematoxilina es un colorante catinico mientras que la eosina es un colorante aninico perteneciente a los xantenos. Se teirn los ncleos de azul, citoplasmas en rosa, msculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso

Tcnica
1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada. 4- Hematoxilina-5min. 5- Lavar en H2O-2min. 6-Eosina alcoholica-1min. 7-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. - Montaje.

Micrografa de Piel (5X) H&E

Micrografa de Intestino Delgado(5X) H&E

NEUTROS AZUL DE METILENO

METACROMTICO AZUL DE TOLUIDINA

Azul de Metileno

Azul de Toluidina

CONVENCIONALES: H-E TRICRMICOS: Van Gieson, Masson, Gallego. TCNICAS DE PLATA GIEMSA: Extensiones de sangre, citologas PAPANICOLAU: Citologas HISTOQUMICOS: Sudn III Lpidos Carmn de Best, PAS Glucgeno Azul de Prusia Hierro Von Kossa Calcio Orcena Fibras elsticas INMUNOHISTOQUMICOS

Van Gieson Elstica de Van Gieson Es una tcnica para la coloracin de fibras colgenas y elsticas. El colgeno parece que capta un colorante cido. Tie el colgeno de rojo, ncleos y fibras elsticas de negro y citoplasma de amarillo.

Pared de la trquea, Van Gieson.

Van Gieson

Azan (Azocamin + Aniline blue)

Color Rojo Ncleos celulares Color Rosa Citoplasma celular (color rojo-naranja: fibras musculares y hemates) Color Azul Mucingeno Fibras de colgeno

Regin distal del glande. Coloracin: Azan. Escala de reproduccin: 200x

Sales de Plata

color negro-marrn oscuro: Fibras de reticulina, Dendritas Axones neuronales Prolongaciones gliales
Micrografa de un corte transversal de msculo liso teido con sales de plata para la demostracin de fibras reticulares.

Micrografa de Lengua (Mastocitos). Impregnacin argntica. Micrografa de Mesenterio. Impregnacin argntica.

GOMORI (Sales de Plata)

Sustancias especficas mediante reacciones qumicas Sudn III Lpidos Carmn de Best, PAS Glucgeno Azul de Prusia Hierro Von Kossa Calcio Orcena Fibras elsticas

SUDAN ROJO PARA TEIR LIPIDOS SIMPLES 1.- Cortes obtenidos por congelacin (La inclusin en parafina disuelve las grasas). 2.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III y Rojo Escarlata (filtrado). 24 horas. 3.- Lavar en agua destilada. 4.- Teir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos. 5.- Lavar y secar con papel de filtro. 6.- Montar en Plasdona.
Sudan Rojo . Arteria muscular

PAS o del cido perydico de Schiff Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la accin del cido perydico, potente agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso.

Cabeza del Epiddimo de Conejo. PAS 400X

Cuerpo Epiddimo de Conejo. PAS 400X

color rosa-magenta: carbohidratos, mucoprotenas, proteoglicanos

PAS (Glucgeno)

Azul de Prusia (Hierro)

Von Kossa (Calcio)

Orcena (Fibras elsticas)

Est i l si i i l l li i t r fi l s pri t l s pesados y otras sustancias.

l l ipi s i

r it t i t s,

t r l i s,

Se considera como un nexo de uni n entre la morfologa y la bioqumica

En una reaccin bioqumica hay tres pasos fundamentales: Fijacin: Preservar las estructuras y reactividad funcional celulares Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehdo, formaldehdo, etc. Incubacin Consecuencia se liberar unos productos que bien por si mismos, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reaccin. Contraste Para resaltar en lo posible el producto de reaccin y permitir una ptima visualizacin del ncleo y del citoplasma.
Las reacciones reproductibilidad deben tener 3 caractersticas: sensibilidad, especificidad y

Deteccin de antgenos (biomolculas) en clulas/tejidos mediante anticuerpos marcados in situ.

INMUNOFLURECESCIA

Fluorescena

Vimentina

INMUNOFLURECESCIA

Rodamina

GFAP

INMUNOENZIMATICAS

Islotes de Langerhans (Pncreas) Insulina Glucgon

Corteza Cerebral Isomastotatina VIP

FOSFATASA ALCALINA

FOSFATASA ACIDA

ESTERASAS

INMUNO ORO (ORO COLOIDAL)

NEUROHIPOFISIS

Es la distancia mnima que debe separar a dos objetos para que sean percibidos como dos objetos diferentes al ser observados con el microscopio

Parafina / 7 m PAS-Hematoxilina frrica

Resina Epon / 1 m Azul de toluidina

Seleccin de la muestra Fijacin de la muestra Inclusin de la muestra Corte de la muestra Contraste [tincin] de los cortes [Montaje de los cortes] Examen de los cortes con el M.E.

La fijacin hace que precipiten las protenas tisulares

Finalidad Preservar los tejidos de forma similar a su estado in vivo Aumentar la dureza de la muestra para facilitar su posterior corte

FIJADORES USADOS Solucin tamponada de glutaraldehdo 2,5-5% Solucin tamponada de tetrxido de osmio 1-2%

Finalidad Endurecer la muestra homogneamente para obtener cortes ultrafinos Mtodo de inclusin en resina
Lavar el fijador en exceso de la muestra con una solucin tampn Contrastar en bloque (con acetato de uranilo, p. ej.) Deshidratarla muestra con alcoholes de gradacin creciente Pasar la muestra por un disolvente (xido de propileno...) Introducir la muestra en una mezcla 1:1 de resina y disolvente a temperatura ambiente para que la muestra se embeba de resina Introducir la muestra en resina pura [en una cpsula de gelatina o plstico] a 60oC para que polimerice y forme un bloque de resina que contenga la muestra

Citrato de plomo Acetato de uranilo

Interpretacin de Cortes Histolgicos

El microscopio ptico tiene un limite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m ). Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m ) Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas

Sistema Mecnico Sistema ptico

Sistema ptico
OCULAR Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO Ampla la imagen de la preparacin CONDENSADOR Lente que concentra sobre la preparacin. DIAFRAGMA Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FUENTE DE ILUMINACION Dirige los condensador. rayos luminosos hacia el los rayos luminosos

Sistema Mecnico
SOPORTE Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL Contiene los sistemas de lentes oculares. REVLVER Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE Macromtrico que aproxima el enfoque. Micromtrico que consigue el enfoque correcto.

MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

Empleo del objetivo de inmersin: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. c. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. d. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. j. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. 5- Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcoholacetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
6- No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7- El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. - Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. 9- Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.

Utiliza un haz de electrones para producir la imagen. Permite conocer la ultraestructura de las clulas y de la matriz extracelular Filamento Calentado

Lente Magntica Espcimen Lente Objetivo

Lente Proyector Imagen sobre Fluorescente Pantalla

El haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificacin de las imgenes. Filamento Calentado

Lente Rayo Deflector Lente Pantalla Visora

Detector

Resina Epon / 1 m Azul de toluidinan

MICROSCOPIO PTICO
Fuente de luz comn. Se pueden observar clulas y tejidos vivos y muertos. Con frecuencia las muestras se someten a tcnicas de tincin con colorantes.

MICROSCOPIO ELECTRNICO
Haz de electrones. Solo se pueden observar clulas muertas. Las muestras se tratan con sales metlicas.

Las muestras se cortan en secciones ultra finas El material biolgico tiene un de 50 a 100 um. de espesor utilizando grosor entre 1 y 10 um. se corta con ultramicrtomo. micrtomo. ME de barrido: los M electrnico de electrones chocan con transmisin: los Los rallos de luz atraviesan la muestra. electrones atraviesan la la muestra y rebotan. muestra. Poder de resolucin: 0,2um. Brinda informacin topogrfica y da una imagen muy reducida. PR: 0,2 - 0.5 um. Proporciona informacin de la ultraestructura celular. PR: 10 um. Da una imagen topogrfica y tridimensional del objeto.

PREGUNTAS..