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Desarrollo histrico
Secuenciacin de cidos nucleicos. Inicialmente, se pensaba que la secuenciacin de los cidos nucleicos era mucho ms difcil que la de las protenas, y muy poco progreso se hizo hasta 1960. Por otro lado, el hecho de tener cuatro componentes solamente, se pensaba, hara ms fciles los analices finales. Hoy, la secuenciacin de cidos nucleicos es ms rpida y simple que la secuenciacin de protenas.
Desarrollo histrico
En 1977, se reportaron dos protocolos para la secuenciacin de ADN. El primer mtodo fue el de Maxam y Gilbert. Con este mtodo, al igual que con el de Sanger, se obtiene una autoradiografa en donde puede leerse una secuencia. Se determina la secuencia de una molcula de ADN utilizando qumicos que cortan en posiciones especficas fragmentos marcados en sus extremos 5.
Desarrollo histrico
El segundo mtodo es el de Sanger. ste utiliza un templado de ADN de cadena sencilla para sintetizar la hebra complementaria, la cual se termina en posiciones especficas. En los dos casos, la secuencia de la molcula se determina por diferencias en los tamaos de los fragmentos generados.
Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico) comparten etapas comunes. Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.
Gel de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y mejor separadas. (Sanger
y Coulson, 1978).
Gel de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas ms delgadas y mejor separadas. (Sanger
y Coulson, 1978).
Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada contine extendindose. La incorporacin de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaos posibles que terminan en un residuo especifico.
Figura 6. El mtodo de Sanger. Cuatro reacciones con ddNTPs diferentes permiten la sntesis de distintos fragmentos con una terminacin especfica. Estos fragmentos se pueden separar por electroforesis y comparando los tamaos, se puede determinar la secuencia del templado.
Ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo automtico de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.
http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia3a.htm
Microarreglos
Definicin
Diseada por Brown P.O. y Botstein D. en 1999. Un conjunto ordenado de genes en una pequea superficie (10,000 muestras por cm2). Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biologa molecular y las ciencias genmicas. La mayora de los investigadores interesados en observar cambios en los niveles de expresin gnica, tenan que estudiar gen por gen. Es posible hacer preguntas a todos los genes de un organismo determinado, en un solo experimento.
Microarreglos de ADN
En los ltimos aos de la dcada de 1990, en los laboratorios de la Universidad de Stanford y de otras universidades de los Estados Unidos, se desarroll un ingenioso mtodo que permite observar el grado de funcionamiento (transcripcin), ya no de un solo gen, sino de un conjunto de miles de genes e incluso de todo un genoma.
El mtodo de los microarreglos , conocidos tambin como pastillas de ADN (DNA chips) Consiste en depositar microgotas minsculas en las microcuadrculas de un casillero virtual de varios miles de espacios sobre el vidrio de un portaobjetos especialmente preparado.
Microarreglos de ADN
La base de toda la tcnica de los microarreglos est en la hibridacin especfica de segmentos de cidos nucleicos desconocidos con los segmentos (diana o blanco) pegados al vidrio. La especificidad de esta hibridacin est dada por la complementariedad de las secuencias desconocidas con las secuencias diana pegadas al vidrio. El grado de exactitud de la complementariedad del segmento desconocido con el segmento diana es fundamental.
Microarreglos de ADN
Una vez ocurrida la hibridacin se ilumina con luz lser el microarreglo para determinar la presencia o la ausencia y el grado de hibridacin de cada uno de los miles de segmentos diana. Como todos los segmentos desconocidos estaban rotulados con fluorescencia, el nivel de fluorescencia en cada punto es proporcional al nivel de hibridacin.
Microarreglos de ADN
Cada uno de los miles de cuadritos ( o crculos) de un microarreglo corresponde a una reaccin diferente de hibridacin. Lo fundamental en los microarreglos es que se realizan todas las hibridaciones simultneamente y se analizan como un sistema, es decir que se puede visualizar todo el genoma funcionante, o sea la expresin no ya de un gen sino del genoma.
Microarreglos de ADN
Como cada tipo celular expresa solo una parte del genoma, en los microarreglos hay dos conjuntos diferentes de hibridantes: Mientras que los segmentos diana representan la totalidad del genoma, los segmentos desconocidos deben provenir de un solo tejido o tipo celular para poder ser correctamente interpretados. Hepatocitos Queratinocitos Adipocitos
Microarreglos de ADN
Tambin pueden utilizarse las bibliotecas de cDNA de un rgano, que aunque contiene varios tejidos, acta como una unidad funcional. Rin, Pncreas, Cerebro.
Las hibridaciones deben interpretarse como un conjunto de expresiones gnicas de ese rgano.
Microarreglos de ADN
Por consiguiente los microarreglos permiten la definicin de un perfil de expresin gnica de un tejido Determinar ese perfil de expresin gnica para conocer el estado funcional de dicho tejido. No obstante si existen variaciones por las mismas condiciones del ambiente, los perfiles pueden variar. Razn principal para realizar comparaciones. Comparar el conjunto de hibridaciones de un tejido control con el de un tejido experimental
3. Obtencin del cDNA de las dos muestras (RT) en presencia de nt marcados con distintos fluoroforos en cada muestra = distinguir.
Para estudiar
Tejidos tumorales versus el tejido normal, La interaccin entre agente patgeno microbiano y husped Efecto de distintas drogas (tejido tratado versus no tratado) Efecto del envejecimiento (joven vs. envejecido)